دانشکده علوم
پايان نامهي کارشناسي ارشد رشتهي زيست شناسي سلولي و مولکولي
بررسي ارتباط چند شکلي ژنتيکي ژن هايCAT C-262T وNQO1 C609T با خطر رد حاد پيوند کليه
به کوشش
مهسا صحرائيان
استاد راهنما
دکتر ايرج سعادت
شهريور1392
به نام خدا
اظهارنامه
اينجانب مهسا صحرائيان دانشجوي رشته زيست شناسي گرايش سلولي و مولکولي دانشکده علوم اظهار مي کنم که اين پايان نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهايي که از منابع ديگران استفاده کرده ام و نشاني دقيق و مشخصات کامل آن را نوشته ام. همچنين اظهار مي کنم که تحقيق و موضوع پايان نامه ام تکراري نيست و تعهد مي نمايم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهاي آن را منتشر ننموده و يا در اختيار غير قرار ندهم. کليه حقوق اين اثر مطابق با آيين نامه مالکيت فکري و معنوي متعلق به دانشگاه شيراز است.
نام و نام خانوادگي: مهسا صحرائيان
تاريخ و امضا:
تقديم به
پدر و مادر عزيزم
سپاسگزاري
سپاس يگانه اي را که زمين بر گرد عرش کبريائي او ميگردد و آسمان به رنگ مهرباني اوست
معبودي که دريا در برابر شکوهش پيشاني به سنگ مي سايد و کوه در برابر عظمتش بر جاي مانده است.
سپاس که با علم و ايمان به حيات دنيا و عقبايم معنا بخشيدي!
در طول مراحل مختلف انجام اين پژوهش، از همكاري افراد بزرگواري برخوردار بوده‌ا‌‌م كه لازم مي‌دانم از يكايك اين عزيزان مراتب تقدير، تشكر و سپاسگزاري را به جاي آورم.
از مادر عزيز و مهربان و پدر دلسوزم که همواره با صبر و بردباري و تشويق و دلگرمي هايشان اميد به آينده را در من تقويت نمودند، تشکر ويژه کرده و دستانشان را بابت همه چيز
مي بوسم.
مراتب سپاس و قدرداني خود را نسبت به زحمات بي دريغ استاد راهنماي ارجمندم جناب آقاي دكتر ايرج سعادت، به خاطر تقبل راهنمائي اينجانب، صبر و حوصله فراوان و منابع مفيدي که در اختيار بنده گذاشتند، ابراز مي دارم.
راهنمايي‌هاي ارزشمند، سازنده و زحمات استاد مشاور ارجمندم جناب حميدرضا کربلايي و دکتر محمد حسين کريمي را در راستاي پيشبرد پايان نامه اينجانب ارج مي نهم.
چکيده
بررسي ارتباط چند شکلي ژنتيکي ژن هايCAT C-262T وNQO1 C609T
با خطر رد حاد پيوند کليه
به کوشش
مهسا صحرائيان
پيوند کليه، درمان انتخابي براي بيماران مبتلا به مرحله نهايي بيماري کليوي يا End Stage Renal Disease (ESRD) است. در بيماران پيوند کليه “رد حاد پيوند کليه” جديترين عارضه محسوب ميشود که در صورت تشخيص سريع، احتمالا برگشتپذير خواهد بود. شواهد زيادي وجود دارد مبني بر اينکه آسيب اکسيداتيو به عنوان فاکتور مهم در پيدايش و پيشرفت تعدادي از بيماريها از جمله سرطان، بيماريهاي عصبي، ديابت و بيماري مزمن کليوي نقش دارد. آنزيمهاي NQO1 و کاتالاز ( CAT) از جمله آنزيمهاي آنتي- اکسيدانت هستند، که از سلولها در برابر آسيب اکسيداتيو محافظت ميکنند. هدف از اين مطالعه، بررسي ارتباط چند شکلي ژنتيکي ژنهاي CAT C-262TوNQO1 C609T با خطر رد حاد پيوند کليه ميباشد. در اين مطالعه مورد-شاهدي 224 فرد سالم به عنوان گروه کنترل و 222 نفر بيماران پيوند کليه شرکت داشتند. از روش PCR-RFLP جهت تعيين ژنوتيپ چند شکليهاي ژنتيکي استفاده کرديم. با توجه به نتايج بدست آمده ارتباط معنيداري بين فراواني ژنوتيپها و آللهاي ژن NQO1 در دو جمعيت سالم و بيماران پيوندي مشاهده نشد درنتيجه ميتواند حاکي از اين باشد که فراواني ژنوتيپي و آللي ژن NQO1 در بروز بيماريهاي کليوي منجر به پيوند کليه نقشي ندارد. در مورد ژن CAT از مقايسه ژنوتيپهاي ژن کاتالاز در دو جمعيت سالم و بيمار اختلاف معنيدار فقط در ژنوتيپ CT اين ژن مشاهده شد که اين عامل ميتواند در آسيبهاي کليوي که سبب نارسايي شديد کليه و در نهايت منجر به پيوند ميگردد نقش داشته باشد. (51/1=OR، 25/2=95%CI، 043/0=P) همچنين مقايسه فراواني ژنوتيپي و آللي اين دو ژن بين دو گروه بيماران با رد حاد و فاقد رد حاد پيوند انجام شد که در ژن CAT هيچ ارتباط معنيداري مشاهده نشد. (05/0<P) و در ژن NQO1 تنها در آلل T اين ژن ارتباط در سطح معني-داري مشاهده گرديد. به اين معني که آلل T به ميزان 64/1 برابر خطر رد حاد پيوند کليه را افزايش ميدهد.
(64/1 =OR، 73/2-99/0 = %95 CI، 05/0 =P)
کليد واژه: پيوند کليه، رد حاد پيوند، CAT, NQO1
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
1.1- پيوند کليه 2
2.1- رد پيوند کليه 4
3.1- رد حاد پيوند 4
4.1- DGF 6
5.1- آنتي بادي هاي ضد HLA 6
6.1- آنتي بادي عليه آنتي ژن هاي گروه خوني 7
7.1- افزايش سن اهدا کننده و دريافت کننده پيوند 7
8.1- اهدا کننده بافت 8
9.1- استرس اکسيداتيو و آنتي اکسيدانتها 8
10.1- کاتالاز 9
11.1- NAD(P)H کوئينون اکسيدوردوکتاز1 11
12.1- هدف12
13.1- فرضيه 12
عنوان صفحه
فصل دوم: مروري بر تحقيقات پيشين
1.2- مطالعات انجام شده بر روي ژن کاتالاز 14
2.2- مطالعات انجام شده بر روي ژن NQO1 16
3.2- مطالعات پيشين انجام شده در خصوص پيوند کليه 18
فصل سوم: مواد و روش ها
1.3- نمونهگيري 20
2.3- وسايل مورد نياز 21
3.3- محلولهاي استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل 21
4.3- محلولهاي استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافيکت 21
5.3- مواد لازم جهت انجام PCR 22
6.3- مواد لازم جهت انجام الکتروفورز 22
7.3- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزيم محدودکننده 22
8.3- استخراج DNA از خون محيطي 22
9.3- استخراج DNA از بافيکت با کيت DNP 23
10.3- PCR 24
11.3- الکتروفورز 27
12.3- رنگآميزي ژل 28
13.3- تحليل آماري 29
عنوان صفحه
فصل چهارم: نتايج
1.4- مشخصات افراد شرکت کننده در اين مطالعه 31
2.4- نتايج حاصل از بررسي ريسک فاکتورهاي دخيل در رد پيوند کليه
و مشخصات بيماران 31
3.4- نتايج حاصل از بررسي چندشکلي ژن CAT در افراد سالم
و بيماران پيوند کليه 33
4.4- نتايج حاصل از بررسي چندشکلي ژن NQO1 در افراد سالم
و بيماران پيوند کليه 34
5.4- مقايسه فراواني ژنوتيپي و آللي بين دو گروه سالم و بيمار 35
6.4- مقايسه فراواني ژنوتيپي و آللي بين بيماران با رد حاد پيوند
و بيماران فاقد رد حاد پيوند 36
7.4- بررسي ارتباط ژنوتيپهاي ژن CAT و NQO1 با ريسک
فاکتورهاي رد حاد پيوند کليه 38
فصل پنجم: بحث و نتيجهگيري
بحث و نتيجهگيري 40
پيشنهادات 45
فهرست منابع و مأخذ 46
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1.3- 20
جدول 2.3- مواد مورد نياز جهت تهيه مخلوط واکنش PCR 24
جدول 3.3- برنامه تنظيم شده براي واکنش PCR جهت تکثير ژن NQO1 25
جدول 4.3- قطعات حاصل از هضم آنزيمي براي ژنوتيپهاي
چندشکلي ژنتيکي NQO1 26
جدول 5.3- برنامه تنظيم شده براي واکنش PCR جهت تکثير ژن CAT 26
جدول 6.3- قطعات حاصل از هضم آنزيمي براي ژنوتيپ هاي
چندشکلي ژنتيکي CAT 27
جدول 1.4- بررسي ريسک فاکتورهاي دخيل در رد پيوند کليه
و مشخصات بيماران 32
جدول 2.4- بررسي ريسک فاکتورهاي کمي دخيل در رد پيوند کليه
و مشخصات بيماران 33
جدول 3.4- مقايسه ژنوتيپ هاي ژن CAT در گروه سالم و بيمار پيوند کليه 33
جدول 4.4- مقايسه ژنوتيپ هاي ژن NQO1 در گروه سالم و بيمار پيوند کليه 34
جدول 5.4- آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي ژنCAT در بين گروه سالم
و بيماران پيوند کليه 35
جدول 6.4- آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي ژنNQO1 در بين گروه سالم
و بيماران پيوند کليه 35
عنوان صفحه
جدول 7.4- آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي در ژن CAT
در بين بيماران پيوند کليه 37
جدول 8.4- آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي در ژن NQO1
در بين بيماران پيوند کليه 37
جدول 9.4- اثر ريسک فاکتور منبع بافتي باژنوتيپ هاي ژنCAT 38
جدول 10.4- اثر ريسک فاکتور منبع بافتي باژنوتيپ هاي ژن NQO1 38
فهرست شکلها
عنوان صفحه
شکل 1.1- ساختار ژن CAT و چندشکلي ژنتيکي CAT C-262T 10
شکل 2.1- ساختار ژن NQO1 و چندشکلي ژنتيکي NQO1 C609T 11
شکل 1.3- نتايج حاصل از PCR-RFLP چندشکلي ژنتيکي CAT C-262T
قابل مشاهده بر روي ژل آگاروز 28
شکل 2.3- نتايج حاصل از PCR-RFLP چندشکلي ژنتيکي NQO1 C609T
قابل مشاهده بر روي ژل آگاروز 29
فصل اول
مقدمه
1.1-پيوند کليه
پيوند کليه به عنوان درمان انتخابي براي بيماران با مرحله نهايي بيماري کليوي1 (ESRD) که از عوامل مختلف ناشي ميشود، تبديل شده است. ESRD نشانه اي براي پيوند کليه است که در آن ميزان فيلتراسيون گلومرولي کليه به کمتر از ml/min 15 ميرسد. پيامد هاي پيوند در طول سالهاي اخير به طور قابل توجهي بهبود يافته است. (Sayegh MH et al, 2004, Keith DS et al,2005)
پيوند کليه يک انسان به انسان ديگر بنام Renal allograft ناميده ميشود که دهندهي کليه، انسان زنده (خويشاوند، غير خويشاوند) يا جسد (عمومأ دچار مرگ مغزي) ميباشد. (Phadke G et al, 2011) تا سال 1389 جمعيت بيماران دچار نارسايي کليه در ايران 320 هزار نفر بوده است که 49% اين بيماران از روش درماني پيوند کليه، 48% از روش دياليز خوني و 3% از روش دياليز صفاقي استفاده ميکردند. (Zwieble William J et al, 2000)
براي پيشگيري و درمان پس زدگي عضو پيوندي از داروهاي سرکوب کننده سيستم ايمني استفاده ميشود. اين داروها انواع متنوعي دارند که هر کدام با مکانيسم جداگانهاي باعث سرکوب سيستم ايمني ميشوند و با توجه به شرايط بيمار معمولا يک ترکيب سه دارويي يا دو دارويي براي بيمار تجويز ميشود، معمولترين داروهايي که استفاده ميشود شامل: سانديمون، سل سپت، پردنيزولون و اف کا ميباشد. به دليل استفاده از اين داروها گيرندگان پيوند کليه در معرض ابتلا به عفونت و برخي از بدخيميها ميباشند، علاوه بر موارد ذکر شده ممکن است بافت پيوندي دچار پسزدگي شود براي پيشگيري از عوارض مطرح شده، قبل از پيوند آزمايشات کامل فيزيکي براي تشخيص و درمان مواردي که ميتواند پس از عمل پيوند باعث بروز مشکلاتي در بيمار شود، انجام ميگيرد. تعيين نوع بافت، گروه خون و آنتي بادي، براي تعيين هماهنگي بين بافت و سلولهاي دهنده و گيرنده ضروري است. گيرنده پيوند در زمان پيوند نبايد هيچ گونه عفونتي داشته باشد، زيرا پس از عمل به دليل استفاده از دارو هاي سرکوب ايمني در معرض خطر عفونت قرار دارد. (Cornell et al,2008) علم پيوند کليه در نيم قرن گذشته به طور قابل توجهي پيشرفت کرده است که عمدتأ به دليل درک بهتر سيستم ايمني بدن در رد پيوند و مديريت بهتر سرکوب سيستم ايمني ميباشد.
(Morris PJ, 2004, Sayegh MH et al, 2004)
تهديد ايمنولوژيک پيوند کليه قبل از پيوند شروع ميشود و ناشي از اثرات سيستميک مرگ مغزي دهنده يا ايسکمي- ريپرفيوژن حين عمل ميباشد. ايسکمي به دنبال ريپرفيوژن بيان آنتي ژنهاي HLA2 را بالا ميبرد و باعث به راه افتادن آبشاري از کموکاينها، سيتوکينهاي پيش التهابي و مولکولهاي چسبنده در پيوند ميشود. اين افزايش آنتي ژنهاي HLA، پاسخ ايمني و نفوذ سلولي پيوند را تشديد ميکند و هر دو اين پاسخها خطر رد پيوند را افزايش
ميدهد. (Briscoe DM et al, 1998, Kim IK et al, 2008)
اولين پيوند کليه در 17 ژوئن سال 1950 در Ruth Tucker، بر روي يک زن 44 ساله مبتلا به بيماري پلي- کيستيک کليه انجام گرفت. کليه اهدا شده 10 ماه بعد از پيوند رد شد به دليل اينکه هيچ داروي سرکوب کننده سيستم ايمني در آن زمان در دسترس نبود. اولين پيوند موفقيت آميز کليه، در سال 1954 در بوستون و پاريس در بيمارستان بريگهام توسط جوزف موري و همکارانش بر روي دو قلو هاي همسان (رونالد و ريچارد) انجام گرفت. (Petechuk D, 2006) اولين پيوند کليه در ايران در سال 1346 شمسي در شيراز انجام شد.
( Wishart DS, 2008, Ghods AJ, 2002)
2.1-رد پيوند کليه
رد پيوند همواره از موانع اصلي در پروسه پيوند بوده است. پيوند بافت يا سلول از يک دهنده که از نظر ژنتيکي با دريافت کننده پيوند متفاوت است باعث به وجود آمدن يک پاسخ ايمني بر عليه آنتي ژن هاي فرد دهنده پيوند ميشود که اگر کنترل نشود، اين پاسخ ايمني پيوند را از بين ميبرد. رد پيوند ناشي از مکانيسمهاي مختلف مرتبط با آنتي باديها، سيستم کمپلمان، سلولهاي T وديگر انواع سلولها ميباشد. انواع مختلف سلولها در پيوند به عنوان هدف توسط اين واسطهها تحت تأثير قرار ميگيرند به خصوص سلولهاي اندوتليال و سلولهاي توبولي. برخي از واسطههاي التهابي، به عنوان مثال اينترفرون گاما ميتواند حساسيت پيوند به آسيب را تغيير بدهد. رد پيوند را ميتوان به وسيلهي تطبيق مولکولي بين دهنده و گيرنده و به وسيلهي استفاده از داروهاي سرکوب کننده سيستم ايمني بعد از پيوند کاهش داد. (Frohn C et al, 2001)رد پيوند يک پاسخ ايمني تطبيقي است که از طريق ايمني سلولي (بواسطه سلول هاي T کشنده و القاء آپوپتوز سلول هاي هدف) و همچنين ايمني همورال (بواسطه فعال کردن سلول هاي B ترشح کننده آنتي بادي) انجام ميگيرد که اين اقدام توسط اجزاي پاسخ ايمني ذاتي (ماکروفاژ ها و پروتئين هاي ايمني محلول) همراهي ميشود.
3.1- رد حاد پيوند
رد حاد پيوند يک عارضه جدي و مهم بعد از پيوند است و يک عامل مهم در ايجاد رد مزمن پيوند محسوب مي-شود. به نظر ميرسد اين پديده داراي يک زمينهي ايمنولوژيک بوده و سيستم ايمني نقش اساسي دارد. رايج-ترين شکل رد حاد پيوند زماني آغاز ميشود که آنتي ژنهاي دهنده پيوند بوسيلهي سلولهاي عرضه کننده آنتي ژن (APC)3 به لنفوسيتهاي T در گيرنده عرضه شود. (Larsen CP et al, 1990) بيوپسي از کليه پيوندي روش استاندارد براي تشخيص رد حاد است. رد حاد به طور سنتي بر اساس سرعت و شدت فرآيند rejection به گروههاي hyper acute، accelerate acute و acute rejection طبقه بندي ميشوند.
تشخيص رد حاد نه تنها متکي بر علائم و نشانههاي باليني در بيمار است، بکله بر اساس
دادههاي آزمايشگاهي چون بيوپسي بافت صورت ميگيرد. آسيب شناس آزمايشگاه به طور کلي به دنبال سه نشانه اصلي بافت شناسي ميگردد: 1- نفوذ سلول هاي T، که ممکن است با نفوذ ائوزينوفيلها، سلولهاي پلاسما و نوتروفيلها همراه باشد، 2- سازش ساختار آناتومي بافت و 3- آسيب رگهاي خوني. بيماران مبتلا به رد حاد سلولي، يک افزايش ناگهاني در کراتينين سرم، تجمع مايعات و گاهي اوقات تب و tenderness (حساس شدن به لمس) پيوند را نشان ميدهند. با درمان فعلي بروز رد حاد در سال اول پس از پيوند تقريبأ 10-5 % ميباشد. از لحاظ پاتولوژيکي رد حاد با تجمع سلولهاي تک هستهاي در فضاي بين توبولي همراه با التهاب در توبولها و گاهي اوقات در رگهاي خوني تجلي مييابد. (Colvin RB et al, 2006) حملات رد حاد پيوند کليه يک عامل خطر براي بقاء کوتاه مدت و بلند مدت پيوند در نظر گرفته ميشود. (Pallardo LM et al, 2004) تعدادي از عوامل که بقاء کوتاه مدت پيوند را تحت تأثير قرار ميدهند عبارتند از: عملکرد تأخيري پيوند (DGF)4 ، آنتي بادي-هاي ضد HLA، نوع اهدا کننده پيوند، گروه خوني، افزايش سن دهنده و گيرنده پيوند، وزن گيرنده، فشار خون بالا، ديابت و… از عوامل خطر قابل توجه براي از دست دادن پيوند ميباشند که برخي از اين عوامل را به اختصار توضيح ميدهيم.

4.1- DGF
از دست دادن پيوند به علت اختلال در عملکرد مزمن پيوند يک نگراني عمده در دريافت کنندههاي پيوند کليه ميباشد. (Briganti EM et al, 2002, Chapman JR et al,2005) وقوعDGF بيش از 3-2 هفته بعد از پيوند طول ميکشد. علل اختلال عملکرد کليه بسته به مدت زمان پس از پيوند، منبع ارگان زنده يا جسد، نوع سرکوب سيستم ايمني، بيماري هاي زمينهاي و… متفاوت است. تخمين زده شده که در 50-30 % از پيوندها اختلال در عملکرد در طول دوره اوليه پيوند گسترش مييابد. (Giral Class M et al, 1998) DGF را ميتوان بسته به زمان پس از پيوند به دو نوع زودرس و تأخيري تقسيم کرد. اختلال عملکرد حاد يا تحت حاد کليه با افزايش ناگهاني کراتينين سرم آشکار ميشود. اختلال عملکرد تأخيري پيوند معمولأ 6 ماه پس از پيوند بروز ميکند که با بالا رفتن به آرامي کراتينين سرم خودش را نشان ميدهد. اغلب با پروتئنوري با درجه کم و فشار خون بالا همراه است و به ميزان 4-2 % در هر سال اتفاق ميافتد.
5.1- آنتي باديهاي ضد HLA
پاسخهاي خود ايمني عمدتأ بر عليه مولکول هاي سطح سلول که تحت عنوان مولکولهاي 5MHC خوانده مي-شوند، انجام ميگيرد. مولکولهاي MHC در انسان آنتيژن لکوسيت انساني (HLA) ناميده ميشوند. اين مولکولها مسئول ارائه آنتيژنهاي خار ج و داخل سلولي به سلولهاي سيستم ايمني از جمله سلولهاي T هستند. سلولهاي T قادرند مولکول MHC خارجي سلولهاي پيوند (به طور مستقيم) يا بعد از پردازش مجدد در سطح گيرنده سلولهاي عرضه کننده آنتيژن (غير مستقيم) تشخيص بدهد. بدن به طور معمول به مولکول-هاي MHC که از قبل در بدن وجود داشته پاسخ نميدهد مگر اينکه از طريق بارداري، انتقال خون يا پيوند در معرض سلولهاي خارجي قرار بگيرند. هر چه ميزان سازگاري مولکولهاي MHC دهنده با گيرنده بيشتر باشد سيستم ايمني ميزبان کمتر تحريک شده و پايداري بافت افزايش مييابد. (Morris PJ et al, 2004) اهميت آنتيژنهاي MHC در انسان بديهي است به طوري که ميزان طول عمر بقاي پيوند در پيوندهاي خواهر برادري با HLA مشابه به طور قابل توجهي بالاتر از پيوند خواهر برادري با HLA غيرمشابه ميباشد. (Nankivell BJ et al, 2010) تقريبأ 25 % از رد حاد به علت آنتيبادي عليه آنتيژنهاي HLA دهنده صورت ميگيرد. (Colvin RB, 2007)
6.1- آنتي بادي عليه آنتي ژنهاي گروه خوني
در پيوند کليه، گروه خوني دهنده کليه به طور معمول با گروه خوني گيرنده سازگار است. با اين حال، پيوند کليه در گيرندههايي که با فرد دهنده از نظر گروه خوني ناسازگاراند نيز با موفقيت، با استفاده از يک پروتکل تجربي پلاسمافرز يا immunoadsorption که مستلزم حذف آنتيبادي در گيرنده پيوند بعد از عمل است، صورت ميگيرد. پس از حذف، آنتي باديهاي ضد گروه خوني به سطح قبل از پيوند افزايش مييابند. (Lynch RJ et al, 2008)
7.1- افزايش سن اهداکننده و دريافت کننده پيوند
در مطالعهاي که در سال 2010 بر روي عوامل خطر مؤثر در از دست رفتن پيوند انجام شد، نتايج نشان داد که سن اهدا کننده يک عامل پيش آگهي و قابل توجه براي از دست رفتن پيوند است، بدين صورت که با افزايش يک سال در سن دهنده، خطر نسبي از دست رفتن پيوند 05/1 برابر افزايش مييابد. (Khalkhali HR et al, 2010)
8.1- اهدا کننده بافت
اينکه بافت پيوندي از فرد زنده دريافت شده باشد يا از فرد دچار مرگ مغزي، در بقاي طولاني مدت پيوند تأثير-گذار خواهد بود. به طوري که در بيماراني که از فرد زنده و به خصوص از خويشاوندان درجه اول بافت ميگيرند رد پيوند کاهش مييابد. تا سال 1387 در حدود 95-90 % پيوندها از اهدا کنندگان زنده و 5 تا 10 درصد آن از طريق پيوند از جسد انجام ميگرفت، در حال حاضر، 96 درصد پيوندها از جسد و تنها حدود 4 درصد از پيوندها از اهدا کننده زنده دريافت ميشود. همچنين مطالعات انجام شده در اين خصوص حاکي از آن است که حدود 50-20 %، وقوع DGF در بيماراني که از جسد بافت دريافت ميکنند افزايش مييابد که ناشي از اثرات سيستميک مرگ مغزي دهنده يا آسيب اسيکمي- ريپرفيوژن حين عمل ميباشد.
(Nankivell BJ et al, 2010, Giral Classe M et al,1998)
9.1- استرس اکسيداتيو و آنتي اکسيدانت ها
استرس اکسيداتيو در نتيجهي افزايش غلظت گونههاي فعال اکسيژن (ROS)6 و يا کاهش آنتي اکسيدانتها صورت ميگيرد. (Crawford DA et al, 2011) که نشان دهندهي عدم تعادل در ميزان توليد راديکالهاي آزاد و توانايي سيستم دفاع آنتي اکسيداني در رفع واسطههاي واکنش (ROS) و يا ترميم آسيب به وجود آمده مي-باشد. اثرات سمي ناشي از استرس اکسيداتيو که از طريق توليد پراکسيدها و راديکالهاي آزاد ايجاد ميشود به تمام اجزاي سلول از جمله: پروتئينها، ليپيدها و DNA آسيب ميرساند. علاوه بر اين، گونههاي فعال اکسيژن به عنوان يک عامل پيامرسان در سيگنالينگ اکسيد و احياء عمل ميکنند، بنابراين استرس اکسيداتيو ميتواند باعث اختلال در مکانيسمهاي طبيعي سيگنالينگ سلولي شود.
در انسان استرس اکسيداتيو در توسعه سرطان (BarryH , 2007)، بيماري پارکينسون و آلزايمر (Valko M et al, 2007)، آترواسکلروز، نارسايي قلبي (Singh N et al, 1995)، سندرم x شکننده (Diego-Otero Y et al, 2009)، بيماري خوني سلول داسي شکل (Amer J et al, 2006) و چند بيماري ديگر دخيل است. استرس اکسيداتيو شديدتر ميتواند باعث مرگ سلولها شود، استرس اکسيداتيو در حد متوسط ميتواند آپوپتوز را آغاز کند، در حاليکه تنشها شديدتر باشد ممکن است باعث نکروز شدن گردد. (Lennon SV et al, 1991) براي حفظ عملکرد سلولي در برابر ROS، سلولها سيستم دفاعي آنزيمي (به عنوان مثال: سوپر اکسيد ديسموتاز، کاتالاز و گلوتاتيون پراکسيداز) و غير آنزيمي (به عنوان مثال: گلوتاتيون و
ويتامين هايي با نقش آنتي اکسيدان مثل ويتامين C و E) دارند که به وسيله ي آن ROS راسم زدايي ميکنند. (Abdollahi M et al, 2004)
10.1- کاتالاز
کاتالاز آنزيم مشترک در تقريبأ تمام موجودات زنده هوازي ميباشد که تجزيه پراکسيد هيدروژن (H2O2) به آب و اکسيژن را کاتاليز ميکند. (Chelikani P et al, 2004) کاتالاز مجموعهاي از چهار زير واحد يکسان (تترامر) است که هر زير واحد آن داراي وزن مولکولي در حدود 60 کيلو دالتون ميباشد و هر زير واحد داراي يک گروه هِم ميباشد.
(Nagem R et al, 1999)
ژن کاتالاز 34 کيلو جفت باز طول دارد و شامل 12 اينترون و 13 اگزون مي باشد. بخش پروموتر ژن کاتالاز غني از GC و فاقد جعبهي TATA ميباشد. ژن کاتالاز انسان بر روي بازوي کوتاه کروموزوم شماره 11 در موقعيت 13 اين ژن (13P11) قرار گرفته است. (Quan F et al, 1986) تومور ويلمز (Wilm’s Tumor) يک نئوپلاسم رايج دوران کودکي است که با حذف در اطراف باند 13P کروموزوم 11 همراه است. در بعضي از افراد حذف با کاهش فعاليت آنزيم کاتالاز همراه است. در بافت پستانداران بالاترين سطح آنزيم کاتالاز در کبد، کليه و گلبول هاي قرمز و پايين ترين سطح آن در بافت همبند يافت ميشود. Shinga و همکارانش گزارش کردند که در سلولهاي عضله صاف عروق و سلول هاي اندوتليال آنزيم کاتالاز فاقد فعاليت ميباشد. در بافت کبد کاتالاز به طور غالب در پراکسيزومها و در اريتروسيتهاي بالغ بصورت آزاد در سيتوزول وجود دارد. (Quan F et al, 1986)
تجزيه پراکسيد هيدروژن به آب و اکسيژن بوسيله ي آنزيم کاتالاز، يک فرآيند دو مرحلهاي است:
1)H2O2 + Fe(III)-E ? H2O + O=Fe(IV)-E
2) H2O2 + O=Fe(IV)-E ? H2O + Fe(III)-E + O2
با وارد شدن پراکسيد هيدروژن به جايگاه فعال آنزيم کاتالاز، با اسيد آمينه هاي 147Asn و 74His برهمکنش ميکند و باعث انتقال پروتون (يون هيدروژن) بين اتم هاي اکسيژن ميشود که اين انتقال يون هيدروژن به اتم-هاي اکسيژن آزاد سبب تشکيل يک مولکول آب ميشود و Fe3+ به Fe4+ تبديل ميشود. Fe4+ با دومين مولکول هيدروژن پراکسيد واکنش داده، آب و اکسيژن توليد ميکند و به Fe3+ تبديل ميشود. (Vetrano AM et al, 2005)
تعدادي جهش و چند شکلي در ژن کاتالاز گزارش شده که بيشتر آنها با آکاتالاسميا7 که يک صفت آتوزومال غالب بوده و سطح آنزيم کاتالاز گلبولهاي قرمز 2/0-4 % بالاتر از حد نرمال است، همراه ميباشد. (Ogata M, 1991)
چند شکلي که در اين مطالعه مورد بررسي قرار داديم، جايگزيني باز سيتوزين به تيمين در موقعيت 262- پروموتر ژن کاتالاز بود که افراد حامل آلل T (CT, TT) نسبت به افراد هموزيگوت براي آلل C(CC) به طور قابل توجهي سطح کمتري از آنزيم کاتالاز را نشان
ميدهند. (Ahn J et al, 2006)
ساختار ژن CAT و جايگاه چند شکلي مورد نظر در شکل زير آمده است.
شکل 1.1- ساختار ژن CAT و چندشکلي ژنتيکي CATC-262T
11.1-NAD(P)H کوئينون اکسيدوردوکتاز1 (NQO1)
NQO1 يک آنزيم سيتوزولي است که قبلأ تحت عنوان DT-diaphorase ناميده ميشد، از آنزيمهاي مهم در متابوليسم زنوبيوتيکها به شمار ميآيد. اين آنزيم احياء دو اکتروني ترکيبات quinoid به هيدروکوئينون را کاتاليز ميکند. از توليد راديکالهاي آزاد و گونه هاي فعال اکسيژني جلوگيري ميکند، در نتيجه از سلولها در برابر آسيب اکسيداتيو محافظت ميکند. همچنين فعال سازي برخي از مواد زيست محيطي پيش ساز سرطان موجود در دود توتون و تنباکو مانند ترکيبات نيتروآروماتيک و آمين هاي هتروسيکليک را کاتاليز ميکند.
(Chen H et al, 1999)
ژن اين آنزيم بر روي موقعيت 22 بازوي بلند کروموزوم شماره 6 (22q16) قرار دارد. طول اين ژن 20 کيلو جفت باز است که 5 اينترون و 6 اگزون را در خود جاي داده است.
(Ernster L,1987)
چند شکلي مورد بررسي در اين مطالعه مربوط به جايگزيني اسيد آمينههاي سيتوزين به تيمين در موقعيت 609 اگزون شماره 6 ژن NQO1 ميباشد که اسيد آمينه پرولين جايگزين سرين ميشود. (Wiencke JK et al, 1997) اين جهش با کاهش فعاليت آنزيم همراه است و در 25-13 % ازجمعيت سفيد پوستان ديده ميشود. (Chen H et al, 1999) به طوري که آنزيم NQO1 در افرادي که ژنوتيپ TT دارند، يا فاقد فعاليت است يا فعاليت کمي دارد.(Siegel D et al, 1999) و افرادي که ژنوتيپ هتروزيگوت (CT) دارند تقريبأ نيمي از فعاليت آنزيم را دارند.

در شکل زير ساختار و جايگاه چند شکلي ژنتيکي ژن NQO1 آمده است:
شکل 2.1- ساختار ژن NQO1 و چند شکلي ژنتيکي NQO1 C609T
12.1- هدف
از آنجا که رد حاد پيوند در حفظ بافت بصورت کوتاه مدت و بلند مدت داراي اهميت است، مطالعات بسياري بر روي عوامل ايمني و غير ايمني مؤثر در رد حاد پيوند انجام گرفته است. چند شکلي ژنتيکي تک نوکلئوتيدي (SNP)8 از معمولترين تنوعات ژنتيکي در ژنوم انسان هستند و پتانسيل زيادي براي کاربرد در بررسي رابطه آن با تعدادي از بيماريها دارد. راديکالهاي آزاد اکسيژن به عنوان واسطههاي پاتولوژيک در بسياري از بيماري-ها دخيل هستند. استرس اکسيداتيو با پيشرفت بسياري از بيماريها از جمله سرطان، بيماريهاي عصبي، ديابت و بيماري مزمن کليوي مرتبط است.يکي از سيستمهاي دفاعي عليه آسيبهاي ناشي از استرس اکسيداتيو در انسان آنزيم کاتالاز و NQO1 ميباشد،از آنجا که استرس اکسيداتيو مي تواند در نکروز شدن بافت تأثير بگذارد، بر آن شديم تا يک SNP در ژن CAT و يک SNP در اگزون 6 ژن NQO1 را بررسي کنيم. اين مطالعه جهت بررسي ارتباط پلي مورفيسمC-262T ژن کاتالاز وC609T ژن NQO1 با رد حاد پيوند کليه در بيماران دريافت کنندهي کليهي پيوندي ميباشد.
13.1- فرضيه
ژنوتيپTT و CTنسبت به ژنوتيپ CC در چند شکلي ژنتيکي C-262T ژن CAT خطر رد حاد پيوند کليه را افزايش ميدهد.
با افزايش آلل T در ژن CAT، خطر رد حاد پيوند کليه افزايش مييابد.
ژنوتيپ TT و TC از چند شکلي ژنتيکي C609T ژن NQO1 درمقايسه با ژنوتيپ CC خطر رد حاد پيوند کليه را افزايش ميدهد.
با افزايش آلل T در ژن NQO1، خطر رد حاد پيوند کليه افزايش مييابد.
فصل دوم
مروري بر تحقيقات پيشين
1.2- مطالعات انجام شده بر روي ژن کاتالاز
مطالعات بسياري بر روي ژن کاتالاز و رابطه چند شکليهاي ژنتيکي آن با بيماريهاي مختلف انجام گرفته است که به شرح زير ميباشد:
مطالعهاي در سال 2009 توسط Piort Galecki و همکارانش بر روي ارتباط بين پلي مورفيسم عملکردي ژن CAT(C-262T) و احتمال افسردگي راجعه صورت گرفت که نتايج بدست آمده نشان داد هيچ ارتباط معني-داري بين پلي مورفيسم ژن کاتالاز و خطر ابتلا به افسردگي وجود ندارد. (Galecki P et al, 2009)
در مطالعه اي که توسط Ozbay و همکارانش در سال 2011 بر روي ارتباط بين سطح آنزيمهاي آنتي اکسيدانت خون و زمان حمله ميگرن در بيماران مبتلا به ميگرن انجام شد، کاهش آماري قابل توجهي در فعاليت GST-PX، CAT، SOD و سطوح GSH در بيماران مبتلا به ميگرن در مقايسه با گروه شاهد مشاهده شد.(CAT, GSH P<0/001, GSH, SOD P<0/05) در بيماران مبتلا به ميگرن و گروه شاهد تفاوت معنيداري براي ژنوتيپهاي Mn-SOD و CAT مشاهده نشد اما در ژنوتيپ GSH-PX3 تفاوت معنيدار وجود داشت. تفاوتي در فراواني آللي Mn-SOD، CAT و GHS-PX3 در بين بيماران و گروه شاهد نبود. در نتيجه آنزيمهاي استرس اکسيداتيو و آنتي اکسيدانت ها ممکن است نقش مهمي در پاتوژنز ميگرن ايفا کنند. (Ozbey U et al, 2011)

در مطالعهاي که توسط Ahn و همکارانش در سال 2005 در خصوص ارتباط خطر سرطان سينه و ژنوتيپ کاتالاز و استفاده از ميوه و سبزيجات و مکمل هاي غذايي در جزيره لانگ انجام شد نشان داد که فعاليت بالاي ژنوتيپ CC ژن کاتالاز با کاهش 17 % خطر ابتلا به سرطان سينه در مقايسه با افرادي که حداقل يک آلل T دارند (TT,CT) مشاهده شد.
(AhnJ et al, 2005)
در مطالعه اي که توسط Ji-Yeob Choi و همکاران درسال 2007 در بررسي پلي مورفيسمهاي Ala16Val ژن Mn-SOD، C-262T ژن CAT و Pro200Lue ژن GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات بر روي مردان با سابقه کشيدن سيگار يا قرار گرفتن در معرض آزبست بودنند انجام شد، هيچ ارتباطي بين ژنوتيپهاي Mn-SOD، CAT و GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات ديده نشد. (Choi JY et al, 2007)
در مطالعهاي که توسط CristianoCapurso و همکارانش در سال 2008 در ارتباط با رابطه چند شکلي C-262T ژن CAT و بيماري آلزايمر انجام شد ، هيچ ارتباطي بين بيماري آلزايمر و اين چند شکلي مشاهده نشد. (Capurso C et al, 2008)
در مطالعهاي که توسط Zarbock و همکارانش در سال 2007 در ارتباط با خطر بيماري پسودوگزانتوما- الاستيکوم و چند شکلي ژنتيکي C-262T ژن CAT انجام شد، نشان داد که آلل C در اين چند شکلي خطر ابتلا به اين بيماري را افزايش ميدهد.
(Zarbock R et al, 2007)
در مطالعهاي که توسط Chistiako و همکارانش در سال 2006 در رابطه با پلي مورفيسم T>C262 پروموتر ژن کاتالاز و ارتباط آن با نوروپاتي ديابتي نوع 1 در روسيه انجام شد، نتايج نشان داد که آللT 262- در ژن کاتالاز عليه توسعه سريع بيماري نوروپاتي ديابتي نوع1 نقش حفاظتي دارد. (Chistiako DA et al,2006)
در مطالعهاي که توسط Chang Dong و همکارانش در سال 2012 در ارتباط با پلي مورفيسم CAT -21 A>T با سرطان کولورکتال انجام شد، تفاوت معنيداري بين ژنوتيپهاي ژن CAT و همچنين فعاليت آنزيمي پايين تر در بيماران مبتلا به سرطان کولورکتال نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. فعاليت کم آنزيم CAT با افزايش ريسک ابتلا به سرطان کولورکتال در ارتباط است، با اين حال، هيچ مدرکي در حمايت از ارتباط پلي-مورفيسم CAT -21 A>T با خطر ابتلا به سرطان کولورکتال مشاهده نشد. (Chang D et al, 2012)
مطالعهاي در سال 2006 توسط Mak و همکارانش در هنگ کنگ چين بر روي بيماران مبتلا به آسم و ارتباط آن با پلي مورفيسم CAT C-262T صورت گرفت که نشان داد، آلل T در جمعيت غير سيگاري، در برابر بيماري آسم نقش حفاظتي دارد. (Mak et al, 2006)
مطالعهاي در سال 2005 توسط Zhou و همکارانش بر روي دو SNP در پروموتر ژن کاتالاز و ارتباط آن با فشار خون بالا در سفيدپوستان و آمريکاييهاي آفريقايي تبار انجام شد. اطلاعات بدست آمده نشان داد که تغييرات ژنتيکي در منطقه پروموتر ژن کاتالاز با استعداد ابتلا به فشار خون بالا در ارتباط است. (Zhou XF et al, 2005)
2.2- مطالعات انجام شده بر روي ژن NQO1
مطالعهاي درسال 2003 توسط Lin Pو همکارانش در ارتباط با بررسي سه پلي مورفيسم ژنتيکي در ژنهاي NQO1، گلوتاتيون S – ترانسفراز و سوپراکسيدديسموتاز با خطر ابتلا به سرطان ريه در تايوان انجام شد، نشان داد که به طور کلي پلي مورفيسم NQO1 و Mn-SOD با خطر ابتلا به سرطان ريه در ارتباط نيست. افراد حامل آلل نوع GSTP1 در معرض خطر بالاي سرطان سلولهاي سنگفرشي ريه هستند. با در نظر گرفتن عوامل خطري چون وضعيت سيگار کشيدن، جنسيت و نوع بافت بر روي اين پلي مورفيسمها ديدند که نوع وحشي ژن NQO1 با سرطان ريه در افراد سيگاري همراه است. (Lin P er at,2003)
متا آناليزي در سال 2013 توسط Zhu CL و همکارانش در رابطه با پلي مورفيسم C609T ژن NQO1 با سرطان دستگاه گوارش 9(DTC) انجام شد که به طور کلي از لحاظ آماري ارتباط معني داري بين پلي مورفيسم اين ژن وخطر DTC وجود دارد. (Zhu CL et al, 2013)
در سال 2013 توسط Hu Yanlig و همکارانش متا آناليزي در ارتباط با بررسي پلي مورفيسم C609T ژن NQO1 و خطر ابتلا به سرطان مري انجام شد که نتايج بدست آمده نشان داد که ارتباط معنيداري بين ژنوتيپ مغلوب (TT) C609T، NQO1 و سرطان مري وجود دارد. (Yanlig H et al, 2013)
در مطالعهاي که توسط Pandith A و همکارانش در سال 2011 در جمعيت کشميري بر روي ارتباط بين چند شکلي ژنتيکي C609T ژن NQO1 و سرطان مثانه انجام شد، نشان داد که آلل T خطر ابتلا به سرطان مثانه را افزايش ميدهد. (Pandith A et al, 2011)
مطالعهاي ديگر در سال 2011 توسط Stavropoulou C و همکارانش در ارتباط با چند شکلي C609T ژن NQO1 و خطر ابتلا به بيماري هاي آلزايمر و پارکينسون انجام گرفت که در آن آلل T خطر ابتلا به اين بيماري ها را افزايش ميداد. (Stavropoulou C et al, 2011)
مطالعهاي در سال 2013 توسط Liu و همکارانش در بررسي ارتباط پلي مورفيسم عملکردي NQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان سلولهاي کبدي در جمعيت چين انجام شد. نتايج نشان داد در افرادي که ژنوتيپ TT دارند در مقايسه با افراد داراي ژنوتيپ CC به طور قابل توجهي خطر ابتلا به سرطان سلولهاي کبدي افزايش مييابد. (Liu F et al, 2013)
متا آناليزي در سال 2012 توسط Zhang و همکارانش در رابطه با پلي مورفيسم NQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان معده در آسياييها انجام شد. نتايج حاصل از مقايسه آلل T و آلل C اين ژن نشان داد که در افراد داراي آلل T نسبت به افراد داراي آلل C، به طور قابل توجهي شانس ابتلا به سرطان معده افزايش مييابد. (Zhang Y et al, 2012)

3.2- مطالعات پيشين انجام شده در خصوص پيوند کليه
مطالعهاي در سال 2011 توسط Amanda Crawford و همکارانش بر روي فعاليت آنزيمهاي گلوتاتيون پراکسيداز، سوپراکسيدديسموتاز و کاتالاز و پيشرفت بيماري مزمن کليوي CKD)) انجام شد. SNPهاي مورد بررسي شامل: تبديل اسيد آمينه لوسين به پرولين(C>T) در موقعيت 197 ژن GPX1، تغيير اسيد آمينه آلانين به والين (C>T) در موقعيت 16 ژن SOD و C-262T در ژن کاتالاز بود.بررسيهاي انجام شده نشان داد که SNPهاي مورد مطالعه در ژن GPX1 و ژن کاتالاز با پيشرفت بيماري مزمن کليوي ارتباطي ندارد اما در بيماران CKD که در ژن SOD داراي ژنوتيپهاي Ala/Val و Val/Valهستند نسبت به افرادي که داراي ژنوتيپ Ala/Ala هستندکاهش بيشتري در عملکرد کليه شان نشان ميدهند.
(Crawford A et al, 2011)
مطالعهاي توسط Singh و همکارانش در سال 2009 در شما هندوستان بر روي ارتباط بين دو ژن GSTM1 و GSTP1 و رد حاد پيوند کليه انجام گرفت که نشان داد چند شکليهاي اين دو ژن رابطه شديدي با DGF و رد حاد پيوند دارد. (Singh R et al, 2009)
مطالعهاي در سال 2013 توسط Guo Y و همکارانش بر روي پلي مورفيسم ژن CTLA4 و بروز عفونت پس از پيوند کليه در دريافت کنندههاي چيني انجام شد که در آن هيچ ارتباطي بين SNP هاي ژن CTLA
(- 1772 T>C, +49 A>G,+6230 G>A) و عفونتهاي باکتريايي پس از پيوند يافت نشد.
(Guo Y et al, 2013)
مطالعهاي در سال 2008 توسط Pagliuso و همکارانش بر روي چند شکليهاي ژنهاي GSTM1 و GSTT1 با پيشرفت بيماريهاي مزمن کليوي در برزيل انجام شد که نشان داد ژنوتيپهاي null اين دو ژن هيچ گونه ارتباطي با پيشرفت اين بيماري ندارد. (Pagliuso RG et al, 2008)

فصل سوم
مواد و روش ها
1.3- نمونه گيري
در اين طرح، مطالعه بر روي 222 نفر از بيماران پيوند کليه در مرکز پيوند بيمارستان نمازي شيراز طي سالهاي 91_1390 انجام شد که از اين تعداد 144 نمونه خون کامل و 78 نمونه بافيکت بود. DNA را از نمونههاي خون به روش جوشاندن و از نمونههاي بافيکت با استفاده از کيت DNP متعلق به شرکت سيناژن استخراج کرديم. نمونههاي کنترل نيز به تعداد 224 نمونه در اين مطالعه وارد گرديد. در نهايت يک مطالعه مورد-شاهدي بين افراد سالم و بيماران پيوند کليه و يک مطالعه کوهورت بين بيماران پيوند داراي رد حاد و فاقد رد حاد انجام شد. جدول 1.3 مشخصات اين بيماران را نشان ميدهد. در اين مطالعه رد حاد پيوند به افرادي اطلاق ميگردد که در طول 6 ماه اول پيوند با بيوپسي (نمونه برداري از بافت) رد حاد آن ها تاييد شدهاست.
جدول 1.3:
مشخصاتسالمبيماران پيوند کليهتعداد کل
ميانگين سن224
14/15±49/40222
54/14±68/41
2.3- وسايل مورد نياز
وسايل استفاده شده در اين پروژه شامل:
سمپلر(Brand, Socorex)، ترازو، ميکرو سانتريفيوژ (Hettich)، ورتکس (Scientific industries INC)، اتوکلاو (ريحان طب)، مايکروفر (بوتان)، دستگاه ترموسايکلر (Techne)، Hot plate(Techne)،Rotator (پديده نوژن پارس)، PH-meter(Metrohm)، Electrophoresis(تانک الکتروفورز و منبع تغذيه جريان الکتريکي پاياپژوهش)، دستگاه Gel documentation(UvitecCambridge).
3.3- محلولهاي استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل
محلولهاي استفاده شده شامل:
NaOH (50 ميلي مولار)، TrisHCl (1 مولار)، محلول NH4Cl (170 ميلي مولار)، محلول NaCl-EDTA (10 ميلي مولار) مي باشد که از طريق روش گفته شده در کتاب Molecular Cloning: A Laboratory Manual تهيه شدند. (Green MR et al, 2012)
4.3- محلولهاي استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافي کت
پروتئاز mg/ml 20 (proteinase K)، Lysis Solution، Wash Buffer (Ethanol Base)
Precipitation Solution(Isoprppanole Base)،Solvent Buffer
5.3- مواد لازم جهت انجام PCR
Taq DNA Polymerase (سيناژن)، dNTPs (سيناژن)، MgCl2 (سيناژن)، بافر 10x(10x buffer) مخصوص PCR(سيناژن) و پرايمر هاي رفت و برگشت ژن CAT و NQO1 (سيناژن)
6.3- مواد لازم جهت انجام الکتروفورز
بافرTBE، محلول اتيديوم برومايد (x1000)، Tris Base (سيناژن)، Boric acid (Merck)، EDTA (Merck) 6xloading buffer (سيناژن)، Agarose(Invitrogen)، 100bp DNA ladder (Vivantis)
7.3- مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزيم محدود کننده
آنزيم محدود کنندهhinf1 و EcoRV(Fermentas) و بافرEcoRV و بافرv3
8.3-استخراج DNA از خون محيطي
استخراج DNA از خون کامل به روش جوشاندن (Boiling) انجام شد که جزئيات روش کار طبق موارد گفته شده در منبع مورد نظر ميباشد. (Newton CR et al, 1995)
9.3- استخراج DNA از بافي کت با کيت DNP
1- 5 ماکروليتر Protease را روي 100 ماکروليتر از نمونه بافي کت ريخته و



قیمت: تومان


پاسخ دهید