بررسي اثر عصاره بافت شش و دم بر تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي به سلولهاي عصبي
چکيده:
مقدمه و هدف: از مهمترين سلولهاي بنيادي بزرگسال که توجه اکثر محققين را به خود جلب کرده است مي توان به سلولهاي بنيادي مزانشيمي اشاره کرد. سلولهاي بنيادي مزانشيمي مشتق از مغز استخوان توانايي تبديل به انواع مختلف سلولها از جمله سلولهاي چربي، استخوان و غضروف را دارند به علاوه اين سلولها را مي توان به سلولهاي نوروني تمايز داد. اغلب موادي که تا کنون جهت القاء سلولهاي بنيادي به سلولهاي عصبي استفاده شده است همچون: اسيد رتينوئيک، دي متيل سولفوکسايد، دپرنيل و …. ترکيبات سمي و پر هزينه هستند. در اين پژوهش از عصاره بافت شش و دم جنين به عنوان القا کننده غير سمي استفاده شده است.
مواد وروشها: سلولهاي بنيادي مزانشيمي از استخوان فمور موشهاي بالغ نژادBALB/C تهيه و کشت داده شدند. پس از 3 پاساژ به وسيله عصاره بافت شش و دم جنين با غلظتهاي 50% و70% و80% در يک گروه به مدت 3 روز و در گروه ديگر به مدت 7 روز القاء شدند. سپس به دو روش بررسي مورفولوژيکي و فلوسايتومتري بررسي گرديدند. دربررسي مورفولوژيکي از کرزيل ويوله و در روش فلوسايتومتري از آنتي بادي نستين و توبولين جهت ارزيابي فنوتيپ عصبي استفاده شد.
يافته ها: نتايج فلوسايتومتري نشان داد که سلولها بعد از القاء به مدت 3 روز ميزان بيان مارکر نستين نسبت به گروه کنترل کاهش معني داري(0.05> P) پيدا کرده است، اما در القا به مدت 7 روز ميزان بيان اين دو مارکرو همچنين ميزان بيان مارکر توبولين در القا به مدت 3 روز افزايش معني داري(0.05> P) پيدا کرده است. تغييرات مورفولوژيکي نيز در راستاي نتايج فلوسايتومتري بود.
نتيجه گيري: تيمار سلولهاي بنيادي مزانشيمي با عصاره بافت شش و دم ميزان وجود نورونها را افزايش مي دهد. اين مطالعه نشان داد که سلولهاي مزانشيمي توانايي تمايز به نورونها را در in vitro دارند و اين مسئله به نوع روش القاء بستگي دارد.
واژهاي کليدي: سلولهاي بنيادي مزانشيمي، سلولهاي نوروني، القاء، تمايز، عصاره شش و دم جنين
مقدمه:
مفهوم سلولهاي بنيادي از قوانين حاکم بر تکوين جنين بدست آمده است. زيست شناسي تکويني شامل مطالعه فرآيند هاي مفهوم سلول بنيادي، قوانين تخم لقاح يافته را به ساختار و عملکرد پيچيده اندام هاي يک کودک سالم تبديل مي کند. در حقيقت يک سلول بنيادي را مي توان يک سلول مادر ناميد يعني سلولي که مي تواند مولد سلولهاي ديگر باشد.
يک سلول بنيادي از ديدگاه دانشمندان به عنوان يک سلول تمايز نيافته تکثير و خودنوزايي و توليد دودمانهاي سلولي متفاوت در نظر گرفته مي شود. به اين ترتيب تخم لقاح يافته به عنوان سلول بنيادي همه توان در نظر گرفته مي شود زيرا توانايي توليد همه نوع سلول و ايجاد يک موجود کامل را دارا است. طي فرآيند ريختزايي سلول ها تکثير يافته، مهاجرت کرده و تمايز مي يابند. بخشي از سلولها پردههاي اطراف جنين را مي سازند و برخي ديگر تشکيل دهنده توده سلول داخل جنين مي باشند. اين دسته سلولها قدرت تشکيل تمام بافتها و سلولها را دارند. توده داخلي جنين واجد سلولهايي است که از قدرت خود نوزايي نامحدود برخوردارند و مي توانند به هر 3 لايه جنين تبديل شوند، اين سلولها به عنوان سلولهاي پرتوان در نظر گرفته مي شوند تا در آينده بر اساس نياز فعال شده به ساير دودمانها تمايز يابند. به اين سلولها، سلولهاي چند توان گويند که توانايي تمايز به تعداد بسياري از بافتها را دارا مي باشند. بارزترين مثال اين سلولها، سلولهاي بنيادي مزانشيمي است. سلولها چند توان در نهايت به سلولهاي بنيادي تک توان يا پيش نياز تمايز مي يابند که تنها قادر به توليد يک رده سلول مي باشند و قدرت خود نوزايي محدودي دارند اين سلولها را مي توان در بافتهاي بالغين جستجو کرد. يکي از ويژگيهاي مهم سلولهاي بنيادي خاصيت تمايزي اين سلولها مي باشد. اين سلولها قدرت تمايز به سلولهاي استخوان، غضروف، ماهيچه، چربي و از جمله نيز مي توانند به سلولهاي عصبي تمايز يابند. استفاده از سلولهاي بنيادي تمايز يافته به سلولهاي عصبي در ترميم آسيبهاي دستگاه عصبي و درمان آلزايمر و پارکينسون يکي از مهمترين برنامه هاي علم پزشکي امروز است. از آنجا که دسترسي به منبعي از سلولهاي بنيادي مناسب يک اصل مهم در سلول درماني است و مغز استخوان منبعي در دسترس و مناسب از سلولهاي بنيادي بالغ است تحقيقات بسياري در زمينه استفاده از سلولهاي بنيادي مغز استخوان انجام شده است.
فصل اول

1-1- مروري برتحقيقات گذشته:
تحقيقات در مورد سلولهاي بنيادي درحدود سال 1970 شروع شد(14). گزارشات متعددي در زمينه تمايز نورونها از سلولهاي بنيادي موش و انسان وجود دارد. بر اساس مطالعات Bainو همکارانش در سال 1995 تأثير رتينوئيک اسيد و تأثير نواحي داراي مورفولوژي روزت بر روي سلولهاي بنيادي جنيني و در پي آن تمايز اين سلولها به سلولهاي عصبي را نشان دادند. همچنين Zhangدر سال 2001 نواحي داراي مورفولوژي روزت را نواحي القا کننده نورواکتودرم اوليه معرفي نمود(6). Okab و همکاران FGF را به عنوان عامل ميتوژن در تکثير سلولهاي بنيادي تمايز يافته معرفي کرده اند و محققين ديگر نيز چونRao و Li وMojtaba با تغييراتي که در روش ساده Bain دادند توانستند در شرايط in vitro تعداد بيشتري ازسلولهاي تمايز يافته عصبي را بدست آورند(12و55). Rolletshekو همکارانش با روش قطرات معلق، کلنيهاي سه بعدي اجسام شبه جنيني1 200 سلولي را بدست آوردند و آنها را به شکل سوسپانسيون در محيط بدون سرم کشت دادند و بعد از انتقال بر پليت پوشيده با پلي ليزين و لامينين در حضورbFGF2و EGF3سلولهاي اجدادي عصبي را تکثير ونورونهاي دوپامينرژيک را تشکيل دادند(59).
سلولهاي بنيادي واقع در مغز استخوان براي اولين بار توسط Friedenstein و Petrakova در سال 1966 شناسايي شدند. اين محققين در مطالعه اي سلولهاي پيش ساز استخوان را از مغز استخوان موش صحرايي استخراج و توصيف کردند. ولي شواهد قطعي توسط Friedenstein در سال 1970 ارائه شد(4). اين محقق نمونه هاي مغز استخوان را در يک ظرف پلاستيکي کشت داد و پس از 4 ساعت يا بيشتر سلولهاي غير چسبنده را دور ريخت. در اصل اين سلولهاي دور ريخته شده سلولهاي رده خونساز بودند. او گزارش کرد که بخش کوچکي از سلولهاي مغز استخوان از لحاظ ظاهر هتروژن بوده در واقع همان بخش که اتصالات محکمي با سطح ديش کشت بر قرار مي کنند چسبنده هستند. اين تجمعات به مدت 2 تا 4 روز خاموش ماندند و پس از آن به سرعت تکثير يافتند. اين سلولها پس از چندين بار پاساژ به صورت يکدست دوکي شکل ظاهر شدند(4). مشاهدت ابتدايي Friedenstein، توسط چندين محقق به ويژه piersma و owen و همکاران در سال 1980 توسعه پيدا کرد(57).
مطالعات قبلي نشان داده اند که سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان توانايي تمايز به سلولهاي عصبي را دارا مي باشند (41). مطالعات مختلفي در زمينه تمايز اين سلولها به سلولهاي نوروني صورت گرفته است.
اولين تلاشها در زمينه تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي به سلولهاي نوروني توسط woodbury آغاز شد وي اين کار را با استفاده از مرکاپتواتانول و DMSO2روي سلولهاي بنيادي مزانشيمي انساني انجام داد و مشاهده کرد که اگرچه تغييرات مورفولوژيکي محسوس در اين سلولها اتفاق مي افتد ولي اين القا روش کارآمدي نمي باشد زيرا سلولهاي حاصل از نظر عملکردي غير فعال بودند. به هر حال اين گزارش اولين نويد در زمينه کاربردي کردن اين نوع از سلولهاي بنيادي در درمان ضايعات نخاعي داده شد. در ادامه Guillermo با استفاده از فاکتورهاي رشد forskolin وbFGF و تهيه بستر مناسبي از پروتئين L-ليزين و کونکاناوالينA وترکيبي از القا کننده هاي شيميايي توانست سلولهاي بنيادي مزانشيمي موش صحرايي را تا حدود 60% به سلولهاي عصبي تمايزدهد. وي مکانيسم مولکولي اين تمايز را خاموش شدن بيان ژنهاي مزانشيمي در مقابل شروع بيان ژنهاي نوروني عنوان کرد. همچنين Andreasو herman نيز توانست با استفاده از محيط فاقد سرم و فاکتورهاي رشدbFGF وEGF کشت اين سلولها بصورت سوسپانسيون سلولهاي مجتمعي مشابه ساختارهاي نوروسفيري را از سلولهاي مزانشيمي بدست آوردند. آنها متوجه شدند کهMSCها بطور عادي 3تا4% پروتئين نستين را در خود بيان مي کنند و بعد از القايي که با استفاده از فاکتورهاي رشد بر روي اين سلولهاي پيش ساز بدست آمد هيچ کدام از پروتئينهاي اختصاصي سلولهاي بالغ نوروني را بيان نمي کردند(21، 31، 45،67،70). نتايج تحقيقات sanchez و woodbury در سال2000، تمايز سلولهاي مزانشيمي به سلولهاي عصبي را در محيط آزمايشگاه با روش مولکولي وسترن بلات مورد تأييد قرار داد(43). براساس گزارش ديگري jiang و همکارانش درسال 2002 جمعيتي از سلولهاي بنيادي را از مغز استخوان موشها جدا کرده و به موشهاي بالغ تزريق کردند. اين سلولها به سلولهاي خوني وسلولهاي عصبي تمايز يافتند(48). همچنين مطالعات سنچز راموس و همکارانش نشان دادند که سلولهاي استرومايي مغز استخوان داراي ظرفيت تمايز به سلولهاي عصبي بوده وي از اسيد رتينوئيک2،BDNF 3، فاکتور رشد عصبي، ترانسفرين و سلنيوم استفاده کرد و به دنبال آن بخشي از سلولها مارکر عصبي Neun (حدود 5 درصد) و بخش ديگر مارکر آستروسيتي GFAP (حدود يک درصد) را بيان کردند(61،71، 60).
سيتوکينها، فاکتورهاي رشد، نوروتروفينها، در محيط کشت باعث تمايز سلولهاي استرومايي مغز استخوان به سلولهاي عصبي در محيط کشت مي شوند، BHA 3، 2 BHT، DMSO، 5-azacytidin، در محيط کشت يا هر عاملي که بتواند سطحCAMP داخل سلولي را افزايش دهد مي تواند اين سلولها را به سمت سلولهاي عصبي سوق مي دهد(71، 74، 28) و همچنين دنگو و همکارانش نيز در تحقيقات خود به اين نتيجه رسيدند که عوامل افزايش دهنده CAMP درون سلولي نظير Isobutyl Methyl Xanthin وDibutyry CAMP نيز موجب تمايز سلولهاي BMSC به سلولهاي عصبي مي گردند(33).
نتايج تحقيقات نعمتي و همکارانش نيز در 2009 نشان داد که اين سلولها با کمک القا کننده EGFو bFGFو رتينوئيک اسيد توانايي تمايز به سلولهاي عصبي را دارا مي باشند، وي توانست تا حدود 90 درصد مارکر نستين و تا حدود 41 درصد مارکر ? توبولين و حدود 67 درصد بيان مارکر GFAPافزايش دهد(21). در طي تحقيقات رضايي و همکارانش در سال 2011 در رابطه با بررسي اثر 4BMP3 در القا سلولهاي عصبي از سلولهاي بنيادي مزانشيمي به اين نتيجه رسيد که 4BMP به عنوان يک عامل بازدارنده تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي به سلولهاي عصبي مي باشد(52).
در ادامه در بررسي اثر ليتيوم کلرايد در القاي سلولهاي استرومايي مغز استخوان به سلولهايي با فنوتيپ عصبي که توسط عليزاده و همکارانش صورت گرفت به اين نتيجه رسيدند که ليتيوم کلرايد در دوز mM 0.5 به عنوان دوز بهينه قادر است سلولهاي استرومايي مغز استخوان را به سلولهاي عصبي تمايز دهد همچنين در اين تحقيقات اثبات شده است که اين دارو در invivo و invitro اثرات محافظتي بربافت عصبي داشته و تکثير سلولهاي پيش ساز عصبي را افزايش مي دهد(18). در تحقيقاتي کاشاني وهمکارانش تأثيرداروي سلژيلين بر ميزان بقا و القاي فنوتيپ عصبي در سلولهاي استرومايي مغز استخوان مورد بررسي قرار گرفت و شمارش سلولي و بررسي آماري نشان داد که غلظتهاي 6-10 و 7-10 و 8-10 سلژيلين، بيشترين تأثير را بر ميزان بقاي سلولهاي استرومايي دارند. غلظت8-10 مولار سلژيلين تأثير بسزايي بر تمايز اين سلولها به سمت سلولهاي عصبي دارد و غلظت مذکور باعث القاي بيان ژنهاي نوروتروفيک NGF و BDNF و GDNF و NT4/5 در سلولهاي تمايز يافته شد(10).
1-2- کليات:
بسياري از بافتهاي بالغ از سلولهايي تشکيل شده اند که نمي توانند جايگزين شوند بعنوان مثال اغلب نورونها و استخوانها در صورتي که آسيب ببيند و يا از بين بروند جايگزين نخواهند شد. با اين وجود جمعيتي از سلولهاي متعدد نيز وجود دارند که سلولهاي آنها بطور دائم مي ميرند و جايگزين مي گردند که ممکن است جمعيتي از سلولهاي بنيادي4 اين سلولهاي از دست رفته را جايگزين نمايند(38).
از ديدگاه دانشمندان سلول بنيادي به يک سلول تمايز نيافته با توانايي تکثير، خود نوزايي2 و توليد دودمانهاي سلولي متفاوت اطلاق مي گردد(13،1). پيشرفتهاي اخير در رابطه با سلولهاي بنيادي بر پايه پتانسيل اين سلولها به عنوان يک منبع بافت براي درمان و ترميم بافت دلالت دارند(43).
1-2-1- سلولهاي بنيادي از نظر منشأ:
بطور کلي سلولهاي بنيادي داراي 3 منشأ اصلي مي باشند که عبارتند از:
1-2-1-1- سلولهاي بنيادي بند ناف ومادري3:
بند ناف يکي ازمنابعي است که سلولهاي بنيادي همه توان4 را دارا مي باشد(38). اين سلولها به علت دسترسي آسان، بدست آوردن بدون مشکل و خطر کم آلودگي ويروسي امروزه بعنوان يک منبع مهم براي بدست آوردن سلولهاي بنيادي مطرح هستند(11).
کشت سلولهاي خون بند ناف در محيط هاي کشت مختلف موجب تمايز اين سلولها به غضروف، سلولهاي کبدي، سلولهاي استخوان، آستروسيت يا نورونها مي شود. پزشکان توصيه مي کنند که سلولهاي بند ناف نوزادان را منجمد کرده تا در آينده براي پيوند در دسترس باشند. ديده شده که وقتي سلولهاي بندناف به موشهاي صحرايي که بافت قلبي آنها آسيب وارد شده بود پيوند زده شد به سلولهاي قلبي تمايز يافتند. (38).
1-2-1-2- سلولهاي بنيادي جنيني5:
سلولهاي بنيادي جنيني از توده سلولي بلاستوسيتهاي2 پستانداران مشتق مي شوند(43،6،48) و برخي معتقدند که از نظر عملکرد معادل بلاستومرهاي توده سلولي داخلي هستند. يکي از بهترين شواهد آن است که وقتي سلولهاي بنيادي جنيني به ICMهاي بلاستوسيت هاي موش تزريق شده اند شبيه بلاستوسيت هاي موش رفتار کرده و در ساختار جنيني شرکت مي کنند(43).
سلولهاي بنيادي جنيني انسان را با استفاده از دو روش اصلي به دست مي آورند. در روش اول اين سلولها از بلاستومرهاي توده سلولي داخلي بلاستوسيت هاي حاصل از لقاح آزمايشگاهي مشتق مي شوند، در روش دوم اين سلولها از سلولهاي زاياي مشتق شده از جنين هايي که به طور خود به خود سقط شده فراهم مي شوند(38).
اخيراً جدا سازي و کشت سلولهاي بنيادي جنيني فرصت هاي جديدي را براي پزشکي به نمايش گذاشته است، اگر چه مشکلات مهمي باقي مي ماند اول اينکه اشتقاق سلولهاي بنيادي از بلاستوسيت هاي بارور در آزمايشگاه مسائل اخلاقي ايجاد مي کنند و دوم اينکه تکنيک هاي اخير براي تمايز به جمعيتهاي سلول سوماتيک فرآورده هاي نا خالص را با پتانسيل تومور زا به بار مي آورد(43). سلولهاي بنيادي جنيني را مي توان در درمان بيماريها و همچنين به عنوان دارو و توکسين مورد استفاده داد(6).
سلولهاي بنيادي جنيني و سلولهاي کارسينوماي جنيني همانند توده سلولي داخلي بلاستوسيتهاي موش تعدادي از نشانگرهاي سطحي سلولهاي پر توان جنيني را نشان مي دهند. اين نشانگرها براي تفکيک سلولهاي EC3و ES4 موشي از سلولهاي ES و EC انساني نيز قابل استفاده هستند. مثلاً سلولهاي EC و ES موشي SSEA-1 5را بيان ميکنند در حاليکه سلولهاي ES و EC انساني آن را بيان نمي کنند و در عوضSSEA- 3 و 4 SSEA- را بيان مي کنند، سلولهاي زاينده بدوي EG6 انساني که از سلولهاي زاينده بدوي(PGCS)
مشتق مي شوند هر سه نشانگر SSEA-1 و SSEA-3 و4 SSEA- را بيان مي کنند. اهميت زيست شناختي الگوي بيان اين آنتي ژنهاي سطحي مشخص نيست اما ممکن است که بيان SSEA-1 درارتباط با صنعت رشد سلولها در محيط آزمايشگاهي باشد. سلولهاي نامتمايز ES و EC انساني تمايل به رشد بصورت کلنيهاي مسطح را دارند و در ضمن کلنيهاي آنها نسبتاً نا متراکم است. در مقابل کلنيهاي ES و EC موشي متراکم چند لايه هستند(7). ساير نشانگرهاي سلولهاي بنيادي جنيني آنتي ژنهاي سطح TRA1-60وTRA1-81 و آنزيم آلکالين فسفاتاز است که تمام آنها را در سلولهاي بنيادي جنيني انسان و موشي که کاريوتيپ غير طبيعي دارند شاخص مزبور را بيان مي کنند(26،27،7).
بطور کلي سلولهاي بنيادي جنيني داراي خصوصيات زير مي باشند:
1. از ICMبلاستوسيتها جدا مي شوند.
2. توانايي تکثير بالايي دارند.
3. سطح بالايي از oct4 را بيان مي کنند، اين فاکتور سبب مهار و تکثير دسته اي از ژنها مي شود که سلولهاي بنيادي جنيني را در حال تکثير و غير تمايزي نگه مي دارد.
4. فعاليت تلومراز را نشان مي دهند.
5. توانايي تشکيل انواع سلولهاي آندودرمي و مزودرمي و اکتودرمي را دارا مي باشند.
6. طي تکوين، داراي توان ادغام در بافتهاي جنيني مي باشند (سلولهاي بنيادي جنيني موش به مدت طولاني در محيط آزمايشگاهي حفظ شده اند و پس از اينکه به داخل يک جنين در مرحله بلاستولاي يک جانور ديگر وارد مي شوند، مي توانند هر بافتي را به وجود آورند که حاصل آن ايجاد جانور کايمرا است).
7. داراي توان کلون زايي مي باشند به اين معني که يک سلول منفرد داراي توان توليد يک کلوني متشکل از سلولهاي با خواص ژنتيکي يکسان مي باشند و يا اينکه کلونها داراي خواص مشابه سلول مبدأ مي باشند.
8. فاقد نقطه کنترل 1G مي باشند، سلولهاي بنيادي جنيني بيشتر زمانشان را در فاز Sمي باشند، برخلاف سلول سوماتيکي تمايز يافته، سلولهاي بنيادي جنيني نيازي به تحريک بيروني آغاز همانندسازي DNA ندارند.
9. سلولهاي بنيادي جنيني، غير فعال شدن کروموزومهاي xرا نشان نمي دهند. در هرسلول سوماتيک پستانداران ماده، يکي از دو کروموزوم x، بطور دائم غير فعال نمي شود غير فعال شدن کروموزوم x در سلولهاي بنيادي جنيني روي نمي دهد(46،43،6،7).
توانايي تمايز سلولهاي بنيادي جنيني به انواع سلولها از جمله سلولهاي عصبي به اثبات رسيده است. سلولهاي اجدادي عصبي که از سلولهاي بنيادي ناشي مي شوند ممکن است که هدايت شوند تا به نورونهاي، بالغ، آستروسيت ها و اليگو دندروسيتها تبديل شوند(43).
در شرايط طبيعي توده سلولي داخلي در طي مراحل گاسترولاسيون سه لايه جنيني اکتودرم، مزودرم، آندودرم را ايجاد مي کند سپس با القاء مزودرم بر اکتودرم موجب تشکيل سيستم عصبي مي شود با در نظر داشتن توان بالقوه سلولهاي بنيادي جنيني در تشکيل انواع سلولها مي توان با القا مسير هاي نورون زايي تمايز آنها را به سمت تشکيل نورون سوق داد. سلوهاي بنيادي جنيني داراي توانايي توليد نورون ها و سلولهاي گليا مي باشند و حتي در مواردي گروههاي خاصي از نورنها مانند دوپامينرژيک مغز مياني را ايجاد مي کنند(6).
سلولهاي بنيادي جنيني در پزشکي اهميت زيادي دارند و نقطه اميد در اينجاست که از سلولهاي بنيادي جنيني در توليد نورونهاي جديد براي بيماران مبتلا به بيماريهاي تحليل رونده مغزي مثل بيماري آلزايمر و پارکينسون يا آسيب هاي نخاعي، توليد پانکراس جديد براي افراد مبتلا به ديابت يا توليد سلولهاي خوني تازه براي افراد به مبتلا به کم خوني استفاده کرد. با وجود اين سلولها اين امکان وجود دارد که سلولهاي قلبي جديدي جايگزين بافت آسيب ديده افرادي شود که مشکل قلبي دارند و کساني که از نقص ايمني رنج مي برند بتوانند سيستم ايمني خود را بازسازي کنند(38).
از ميان سلولهاي بنيادي، سلولهاي بنيادي جنيني به دليل ويژگي خاص همچون تقسيم نامحدود و بدون تمايز و حفظ کاريوتيپ طبيعي کروموزومي بيشتر مورد توجه قرار مي گيرد(6)، اما دستيابي به سلولهاي بنيادي جنيني پر هزينه و دشوار بوده و با مشکلات اخلاقي فراوان روبرو است. بنابراين تحقيق براي منبع جايگزين اين سلولهاي بنيادي ارزش زيادي دارد(11 ).
1-2-1-3- سلولهاي بنيادي بالغ6:
سلولهاي بنيادي بالغ جمعيتي از سلولهاي جنيني هستند که در بدن موجود بالغ وجود داشته و بطور مداوم سلولهاي بنيادي جديدتر و همچنين سلولهايي که متحمل تکوين شده و تمايز مي يابند را توليد مي کنند. در بسياري از موارد سلولهاي بنيادي مي توانند تقسيم شده سلولهاي بنيادي بيشتري را توليد کنند يا زماني که تعادل بدن در اثر بروز ضايعه يا عوامل محيطي به هم مي خورد سلولهاي تمايز يافته بدن را ايجاد مي نمايد(38). اگر چه سلولهاي بنيادي بالغ نسبت به سلولهاي بنيادي جنيني از نظر تمايز محدوديت هايي دارد اما مزيت مهمي که استفاده از سلولهاي بنيادي بالغ را توجيح مي کند اين است که از سلولهاي خود فرد براي جايگزيني ناحيه آسيب ديده استفاده مي شود که به دنبال آن سيستم ايمني فرد فعال نمي گردد و بافت و سلولهاي پيوند زده شده را پس نخواهد زد(16). مغز استخوان بافتي نرم و پر از عروق با داربست هايي از بافت رشته اي رتيکولار بوده که سلولهاي چربي و سلولهاي بنيادي خونساز بر روي اين رشته قرار دارد در اين بافت سلولهاي تشکيل دهنده مغز استخوان و سلولهاي رتيکولار ثابت و بي تحرک بوده و قدرت فاگوسيتي کمي نيز دارد و همچنين سلولهاي مزانشيمي نيز در مغز استخوان جاي گرفته است(13،62).
مغز استخوان منبع اصلي دو نوع از سلولهاي بالغ بنام سلولهاي بنيادي خونساز و سلولهاي بنيادي مزانشيمي مي باشد(14و43).
شکل1-1 نمايي ازساختمان دروني استخوان(24)
1-2-1-3-1 سلولهاي بنيادي خونساز7:
سلولهاي بنيادي اصلي روند خونسازي اغلب به عنوان سلولهاي بنيادي خونساز شناخته مي شوند و توانايي توليد همه انواع سلولهاي خوني و لنفاوي بدن را دارد (38)، همچنين مي تواند سلولهاي هپاتيک تخمدان را نيز توليد کند(44).
سلولهاي بنيادي خونساز مغز استخوان سلولهاي قابل توجهي مي باشند که به عنوان پيشساز مشترک گلبولهاي قرمز (اريتروسيتها)، گلبولهاي سفيد، گرانولوسيتها، نوتروفيلها، پلاکت ها، لنفوسيتها مطرح مي باشند. به نظر مي رسد که سلولهاي بنيادي خونساز پر توان و وابسته به عوامل رو نويسيSCL مي باشند. سلولهاي بنيادي خونساز مي توانند سلولهاي پيشساز خون، سلولهاي پيشتاز مشترک ميلوئيد يا CMP که گاهي CFU-S ناميده مي شوند و سلولهاي بنيادي لنفوسيتي(CLP)را ايجاد نمايند(38).
سلولهاي بنيادي خونساز را براساس مدت زماني که به توليد سلولهاي خوني مي پردازند به دو دسته سلولهاي توليد کننده طولاني مدت2 (LTR) و سلولهاي توليد کننده کوتاه مدت3 (STR) تقسيم مي کنند. سلولهاي توليد کننده طولاني مدت چند توان هستند و به سلولهاي ميلوئيدي و لنفوئيدي تبديل مي شوند. سلولهاي بنيادي ميلوئيدي توليد کننده پيش سازهاي نوتروفيلي، ائوزينوفيلي، مونوسيتي، ماست سل ها، پلاکتها و بازوفيلها هستند، در عوض سلولهاي بنيادي لنفوئيدي پيش سازهاي سلول B و T و سلولهاي کشنده طبيعي مي باشند. بر خلاف LTR ، STRها براي مدت کوتاهي (به اندازه چندين هفته) قادر به تکثير و توليد سلول مي باشند. پيش سازهاي با توان محدود نيز قادر به توليد رده هاي لنفوئيدي و ميلوئيدي هستند، اما پس از چند تکثير تحت تمايز قرار گرفته و يک يا چند نوع سلول بالغ را توليد مي کنند(شکل بعدي) در شرايط نرمال بيشتر سلولها در سطحG1 /G0 به سر مي برند و در اين حالت ترميم DNA و حفظ محتوي ژنتيکي مي پردازند در حاليکه شرايط آسيب يا جراحتها که به کاهش سلولهاي سلولهاي خوني مي انجامد از فاز G خارج و وارد فاز S وM مي گردند (49).
رهبري و هدايت خون سازي نيازمند سه ترکيب اصلي 1- حوضچه سلولهاي بنيادي 2- سايتوکين ها خونساز که هماتوپويزيز را از طريق مکانيسم هاي آندوکراين و پاراکراين تنظيم مي کنند و 3- ريز محيط القايي خونسازي که حاوي استروما و محيط رگي مناسب است(68). شواهد ودلايل اثبات مي کند که سلولهاي بنيادي خونساز نقش حساسي را در ترميم مغز استخوان و نوسازي بافت ايجاد مي کند(29).
شکل1-2 شمايي از مراحل خونسازي خونساز(68)
1-2-1-3-2- سلولهاي بنيادي مزانشيمي8 :
از مهمترين سلولهاي بنيادي بزرگسال که امروزه توجه اکثر محققين رابه خود جلب کرده است مي توان به سلولهاي بنيادي مزانشيمي اشاره کرد. در دسترسترين منبعي که براي استفاده از اين سلولها پيشنهاد مي گردد همان مغز استخوان است. اگرچه اين سلولها از منابع ديگري نيز قابل جداسازي هستند(21).
اين منابع عبارتند از: استروماي بند ناف و بافتهاي متنوع ديگر از جمله پريوستئوم ، استخوان ترابکولي و بافت چربي، ماهيچه اسکلتي، دندانهاي شيري، پانکراس، ريه، کبد رويان، مايع آمينوتيک، خون بند ناف (20).
سلولهاي مزانشيمي که در حفرات استخوان جاي گرفته اند قادرند به صورت تمايز مستقيم2 ساير سلولها از جمله کندروسيتها، استئوبلاستها، فيبروبلاستها، آديپوبلاستها، سلولهاي اندوتليال و ميوسيتها در آزمايشگاه تبديل شوند(13،34،42). بررسي ها نشان داده است که سلولهاي مغز استخوان مي توانند همانند ديگر سلولهاي سوماتيک بنيادي در شرايط معيني به ساير سلولها تبديل شوند و همچنين تحقيقات پيشين انعطاف پذيري3و شکل پذيري سلولهاي بنيادي مزانشيمي به دليل دارا بودن خاصيت خود تجديدي4 و توان تمايز به بافتهاي اسکلتي به عنوان يک منبع مناسب براي استراتژيهاي سلول درماني و ژن درماني محسوب مي شوند. کاربرد اين سلولها در درمان بيماريهاي ژنتيکي به خوبي نشان داده شده است (48،5،47،51). جداسازي و تکثير نسبتاً راحت سلولهاي بنيادي مزانشيمي از مزاياي استفاده از اين نوع سلولها مي باشد(و7313) و همچنين در اکثر مطالعات آزمايشگاهي ثابت شده است که اين سلولها توانايي گريز از سيستم ايمني را دارند و پاسخ ايمني را مهار مي کنند، اين دو ويژگي از نکات مهم در پيوند و سلول درماني مي باشند(21،44،48).
سلولهاي بنيادي مزانشيمي اثر مضر کمي بر روي صفات مي گذارند و در توسعه اين سلولها هيچ نوع کروموزوم غير عادي مشاهده نشده است(48)، اما تکثير متعدد سلولهاي بنيادي مزانشيمي در محيط آزمايشگاه توانايي تکثير، تمايز و لانه گزيني آنها را به تدريج کاهش مي دهد. بنابراين اين امکان وجود دارد که تکثير سلولهاي بنيادي مزانشيمي، کيفيت اين سلولها را جهت مصارف درماني تحت تأثير قرار دهد. از طرف ديگر، توانايي تکثير و تمايز سلولهاي بنيادي به حفظ عملکرد تلومر وابسته مي باشد(تلومر توالي تکراري از نوکلئوتيدهاي GTTAGGG مي باشد که در انتهاي کروموزوم انساني وجود دارد وانتهاي کروموزوم را از تجزيه شدن و نوترکيبي محافظت مي کند)( 2،63).
با وجود اهميت سلولهاي مزانشيمي در سلول درماني هنوز بعضي از جنبه هاي بيولوژيکي آن از قبيل ماهيت سلولي، منشأ تکامل و عملکرد آن در in vivoناشناخته باقي مانده است. پاسخ به اين گونه مسائل و کاربردي کردن سلولهاي بنيادي در درمان بيماريهاي انسان مستلزم مطالعات پيش کلينيکي روي مدل حيواني است(5). تاکنون سلولهاي بنيادي مزانشيمي از مغز استخوان پستانداران مثل رت، گربه، سگ، بابون، خوک، خرگوش، بز، گوسفند با موفقيت جداسازي و ويژگيهاي آنها مورد بررسي قرار گرفته است(14).
موش بعنوان مدل ارزشمند فيزيولوژيک و پاتوفيزيولوژيک پستانداران مي باشد که مطالعه سلولهاي مزانشيمي آن با مشکلاتي از قبيل آلودگي به سلولهاي غير مزانشيمي (خونساز، اندوتليال، ماکروفاژها) و توقف تکثير سلول همراه است(23،37،5). به همين دليل محققين همواره درصدد يافتن راهي مناسب براي جداسازي، تخليص و تکثير سلولهاي مزانشيمي از مغز استخوان موش بوده اند و در اين رابطه روشهاي مختلفي پيشنهاد شده است(37و5). در طي پاساژهاي مختلف در طي آناليزهاي صورت گرفته از سلولهاي بنيادي مزانشيمي سطح کمي از آنتي ژنهاي هماتوپوئيتيک45CD و 14CD و سطح بالايي از 90 CDو 29CD و 44 CD و 105CD و سطح پائيني از 106CD و 166 CDبيان مي شوند(48). در سالهاي خير اين سلولها با اسامي ديگري از قبيل واحدهاي تشکيل دهنده کلوني فيبروبلاستي، سلولهاي فيبروبلاستي مغز استخوان، سلولهاي اجدادي مغز استخوان، سلولهاي داربستي مغز استخوان خوانده شده اند(57،58،3).
جدول1-1- بيان نشانگرها در سلولهاي مزانشيمي مغز استخوان (22)
ويژگي ريخت شناسي و فيزيکيسلولهاي دوکي شکل چسبنده به ظرفنشانگرهاي سطح سلولنشانگرهاي هماتوپويتيک: CD31 neg, CD14 neg, CD45 neg, CD34 negمولکولهاي چسبنده: CD106pos, CD105pos, CD73pos, CD56pos, CD54pos, CD44pos, CD29posاينتگرينها: CD104pos, CD106pos, CD49posفاکتورهاي رشد و سايتوکاينها: CD20pos, CD71pos, CDW119pos, CD140apos, CD126pos, CD124pos, CD123posآنتي ژنهاي معمول گويچه هاي خوني سفيد: MHC class?Antigens neg, CD86 neg, CD3neg,CD80negويژگيهاي عملکرديپتاسيل تمايز به سلولهاي استخوان، غضروف، چربي، عصب، عضله را دارا هستند
جدول1-2- مثالهاي از نامهاي مختلفي که در مطالعات مختلف به اين سلولها داده شده است.(9و25)
نامتعريف
Precursor of non-hematopotic tissueسلولهاي چسبنده مغز استخوان: شامل سلولهاي شبه فيبروبلاست سلولهاي اندوتليال و مونوسيت/ماکروفاژها
Colony forming unit-fibroblast(CFU)
کلنيهاي سلولهاي فيبروبلاست با حضور معمول سلولهاي مونوسيت و ماکروفاژهاMesenchymal stem cell(MSCs)سلولهايي با خاصيت چسبندگي به سطوح جامد شناخته مي شوند
Marrow stromal cellsسلولهاي چسبنده مغز استخوان که شامل سلولهاي شبه فيبروبلاست، سلولهاي اندوتليال و کلونيهاي مونوسيت/ماکروفاژBone marrow stromal (stem) cells (BMSSCS) and/or stromal progenitor cells
سلولهاي غير هماتوپوييتيک با منشأ مزانشيمي که از نظر ريخت شناسي شبيه سلولهاي فيبروبلاست هستند
mMSCs (RS: Recyling stem cell) (m:mature),RS-2, RS-1RS-1: سلولهاي دوکي شکل نازک RS-2:سلولهاي دوکي شکل تقريباٌ نازک mMSCs: سلولهاي دوکي شکل پهن ترMultipotent adult progenitor cells(MAPCs)سلولهاي پيش ساز مشتق از مغز استخوان کشت داده شده.
1-2-2- سلولهاي بنيادي از نظر توان تمايزي:
1-2-2-1- همه توان9:
اين سلولها مي توانند همه سلولها اعم از سلولهاي فرد و سلولهاي برون جنيني را بسازند، مانند بلاستومرهاي يک جنين دو سلولي که هر سلول آن مي تواند يک فرد کامل را بسازد(20و11).
1-2-2-2- پرتوان2:
سلولهايي هستند که مي توانند غالب يا همه سلولهاي فرد را بسازند، مثلاً سلولهاي بنيادي جنيني تحت شرايط خاص مي توانند يک فرد را بسازند، ولي قادر به ايجاد سلولهاي برون جنيني (جفت) نيستند. سلولهايي که از گنادهاي جنيني بدست مي آيند به آنها سلولهاي زاينده جنين3 گفته مي شود(64و7)، نيز جزءاين دسته هستند. سلولهاي تمايز نيافته کارسينوماي جنين مشتق از تراتوکارسينومس ها نيز پر توان هستند (66). تراتوکارسينومسها، تومورهاي تمايز يافته خوش خيم هستند که داراي جمعيتهاي تمايز نيافته زيادي هستند(7).
1-2-2-3- چند توان4:
تعدادمحدودتري از انواع سلول را ايجاد مي کنند(مانند سلولهاي بنيادي واقع در بافتهاي بزرگسال)( 20،7).
شکل1-3 پلاستيسيتي سلولهاي مغز استخوان(56)
1-2-3- تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي به سلولهاي عصبي:
تحقيقات وسيعي در سالهاي اخير در رابطه با تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي به سلولهاي مختلف از جمله سلولهاي عصبي صورت گرفته است، که اين تمايز ممکن است که با تحريکات فيزيکي و شيميايي صورت گيرد. در رابطه با تحريکات شيميايي تحقيقات وسيعي صورت گرفته است(32). در اين روش از مواد مختلف شيميايي مثل مرکاپتواتانول و دي متيل سولفوکسايد و يا از فاکتورهاي رشد سلولي استفاده شده است(21و32).
1-2-3-1- عوامل مؤثر برتمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي در شرايط آزمايشگاهي:
الف)محرکهاي شيميايي:
دردرجه نخست، تمايز اجداد مزانشيمي به دودمانهاي سلولي تحت تأثير محرکهاي شيميايي است که با تغييراتي درمورفولوژي، تکثير بيان ژن و سيگنالهاي مولکولي سلول همراه مي شود.
ب)اتصال سلول به ماتريکس خارج سلولي:
ماتريکس خارج سلولي نقش مهمي در فعال کردن فاکتورهاي رشد دارد اين ماتريکس از مواد آلي و غير آلي از قبيل کلاژن نوع? و نمکهاي منيزيم فلوريد، فسفات و سيسترات تشکيل يافته است. بعنوان مثال وقتي در محيط آزمايشگاه سلولهاي بنيادي مزانشيمي برروي ماتريکس حاوي کلاژن? کشت داده مي شوند به سمت استخوان متمايز مي شوند(19).
ج)همکشتي با سلولهاي ديگر:
از عوامل ديگر در القاي تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي، همکشتي اين سلولها با يک جمعيت متفاوت سلولي ديگر مي باشد. به عنوان مثال کندروسيتها بر تمايز سلولهاي مزانشيمي به سمت استخوان تأثير مثبت دارد. محققين علت را در توليد سيگنالهاي القا کننده تشکيل استخوان توسط کندروسيتها مي دانند(19).
با توجه به تاريخچه موجود در زمينه تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي به سلولهاي نوروني مي توان به اين نتيجه رسيد که در واقع دو نوع القا سريع و طولاني مدت نيز براي القا چنين تمايزي وجود دارد، که دسته اول با استفاده از در معرض قرار دادن اين سلولها به مدت چند ساعت در مواجه با مواد شيميايي خاص صورت مي گيرد و و نوع دوم القا که به مدت زمان بيشتري نياز داشته و با دوام تر هم بوده و سلول را کمتر در معرض استرس قرار مي دهد. اين روش القا با استفاده از فاکتورهاي رشد مي باشد. نتايج حاصل از بررسي هاي مختلف نشان داد که به منظور بدست آوردن نتيجه مناسب لازم است که ترکيبي از فاکتورهاي رشد و عوامل شيميايي براي رسيدن به اين هدف مي توان استفاده کرد(21،53،40).
در مطالعات گذشته از فاکتورهاي رشد EGF و FGF براي به راه انداختن مسيرهاي آبشاري درون سلولي اين سلولها در تمايزشان به سلولهاي نوروني استفاده شده بود(53،40). اما از مسائل حائز اهميت در القا تمايز سلولهاي بنيادي مزانشيمي به سلولهاي عصبي، تمايزاين سلولها به رده آستروسيتي است(30). از همين لحاظ با توجه به اينکه ماده رتينوئيک اسيد منجر به هدايت مسير توليد سلولهاي نوروني را به ميزان مناسبي بالا برد و عدم حضور آن موجب به وجود آمدن دودمانهاي آستروسيتي از اين سلولها مي شود (39). لذا رتينوئيک اسيد نيز به عنوان يک ماده القايي به منظور افزايش توليد سلولهاي نوروني در اين نوع القا استفاده مي شود(39).
سلولهاي مزانشيمي تمايز يافته به سلولهاي عصبي به خودي خود برخي از پروتئينهاي اختصاصي سلولهاي عصبي را بيان مي کنند. بنابراين مي توان از اين سلولها براي درمان مبتلايان به ضايعات نخاعي بهره جست. اما اين مسئله که چقدر سلولهاي بدست آمده از نظر عملکردي فعال باشند و يا اينکه چه عوارضي مي تواند بعد از پيوند موجود در پي داشته باشد هنوز هاله اي از ابهام است(53).
1-2-4- بافت جوانه دم و اندام تحتاني جنين موش:
ناحيه خلفي جنين توسط Nodal،BMP، Wnt، FGF و رتينوئيک اسيد مشخص مي شود، به نظرمي رسد که شيب غلظت بالايي از پروتئينهاي FGF ،BMP، Wnt در قسمت خلفي جنين وجود دارد، که در نزديکي قسمت قدامي جنين بشدت سقوط مي کند. همچنين 8 FGF در قسمت خلفي جنين در حال رشد بيان مي شود ولي بيان آن بتدريج در بافتهاي تازه تشکيل شده کم مي باشد به اين ترتيب شيبي از mRNA 8FGF به شيب پروتئين 8FGF تبديل مي شود. علاوه بر شيب FGF در مرحله انتهايي گاسترولاسيون شاهد شيبي از رتينوئيک اسيد نيز هستيم. اين شيب غلظت RA در نواحي خلفي بالا و در نواحي قدامي پائين است. به نظر مي رسد اين شيب غلظت بوسيله بيان آنزيمهاي سنتز کننده رتينوئيک اسيد در بخش خلفي و آنزيمهاي تجزيه کننده تجزيه کننده رتينوئيک اسيد در بخش قدامي جنين کنترل مي شود. شيب غلظت FGF با اثر بر روي خانواده cdx از ژنهاي وابسته به caudal بخش خلفي جنين را طراحي مي کند(38).
8FGF در رأس خلفي گاسترولاسيون بيان مي شود و بيان آن تا جوانه دمي ادامه دارد. با تجزيه mRNA آن، شيب غلظتي در امتدادبخش خلفي جنين به وجود مي آيد. بالاترين شيب غلظت 8FGF در ناحيه جوانه دمي در قسمت رأسي آن مي باشد(38).
خانواده ژن عامل رشد فيبروبلاستي(FGF) از نظر ساختاري تقريباً شامل 24 عضو خويشاوند مي باشد. اين ژنها از طريق تغيير در پيرايش RNA خود يا رمز آغازين قادر به توليد صدها ايزوفرم پروتئين در بافتهاي مختلف مي باشند، 1FGF بنام FGF اسيدي هم شناخته مي شود و براي بازسازي بافتها ضروري به نظر مي رسد، 2FGF که گاهي به آن FGF بازي هم گفته مي شود، در تشکيل رگهاي خوني بسيار مهم است. يکي از اعضاي اين خانوده بنام 8 FGF جهت تکوين اندام حرکتي داراي اهميت ويژه اي است(54و38).
رتينوئيک اسيد از مشتقات ويتامين A است، که در رشدونمو و تمايز در طي مراحل تکوين مهره داران نقش مهمي را بازي مي کند. رتينوئيدها همانند هورمونهاي استروئيدي و مولکولهاي چربي دوست از بخشهاي هيدروفيليک غشاء عبور مي کنند و جابجايي آنها در داخل سيتوپلاسم توسط پروتئينهاي اتصالي اختصاصي تسهيل مي شود. پس از ورود رتينوئيک اسيد به سلول اين مولکول به پروتئينهاي داخل سلولي اتصال مي يابد. اين پروتئينها دو گروه بوده که تحت عنوان 10 CRABP-? و CRABP-? مي باشند که انتقال رتينوئيدها را به داخل هسته تسهيل مي کند(68).
رسپتورهاي رتينوئيک اسيد متعلق به خانواده گيرنده هاي هورمونهاي تيروئيدي- استروئيدي هستند. سيگنالهاي رتينوئيک اسيد توسط رسپتورهاي رتينوئيک اسيد RARs و RXRsانتقال مي يابد. اين رسپتورها شامل ?،?،? هستند. پس از اتصال هر يک از اين ليگاندها به رسپتورهايشان و اتصال آنها با منطقه پيوند شونده DNA موجب القا فعاليت ژنهاي خاص شده و باعث نسخه برداري و سنتز mRNA و پروتئنهاي مي شود که در القاء، تکثير و تمايز سلول نقش دارند(68).
رتينوئيک اسيد فاکتور مهم در تکوين اندام حرکتي مي باشند. رتينوئيک اسيد درون زاد در بخش خلفي اندام حرکتي جنين در غلظت بالايي توليد مي شود. رتينوئيک اسيد در سازماندهي محور قدامي-خلفي و پشتي -شکمي نقش دارد(8).
1-2-5- بافت شش:
در طي چند سال اخير اثر رتينوئيک اسيد در فرآيند شکل گيري ناي و bronchopulmonary به اثبات رسيده است. در واقع زمانيکه موشهاي تازه از شير گرفته شده در رژيم غذايشان دچار فقدان رتينول بودند در مورفولوژي ناي آنها متاپلازي keratinized قابل توجهي مشاهده شد، ناي و bronchopulmonary اندامهايي هستند که به فقدان رتينول حساس هستند. مطالعات در مورد جمع آوري رتينول (R)در جنين موش نشان داده شده که 3 مرحله برتر در طي 21 تا 22 روز بارداري وجود دارد. مرحله اول(روزهاي 7 تا9) که در اين مرحله غلظت بالايي از رتينول جمع آوري شده و ساختار اوليه بافت شش نيز پديدار شده است. مرحله دوم (روزهاي 11تا14) رتينول و RBPهاي که از مواد گردش يافته به آن منطقه انتقال يافته اند جمع آوري شد. مرحله سوم (16-20روز) شروع توليدRBP در جنين مي باشد. بيشتر فاکتورهايي که در پيدايش ششهاي نوزاد دخيل هستند در فرآيند به بلوغ رسيدن اپيتليوم bronchoplumonary درگير مي شوند(36).
جابجايي رتينوئيک اسيد در داخل سيتوپلاسم سلول توسط پروتئينهاي اتصالي اختصاصي صورت مي گيرد که اين پروتئين CRABP مي باشد. CRABP پروتئيني است که انتقال رتينوئيد را به داخل هسته تسهيل مي کند. بعد از تولد سطح CRABP افزايش پيدا مي کند و 10 روز اول پس از تولد مقدار CRABP به بالاترين حد خود مي رسد و پس از 21 روز ديگر قابل مشاهده نمي باشد (36). اين موضوع نشان مي دهد که مقدار رتينوئيک اسيد در روز دهم پس از تولد به بالاترين حد خود مي رسد.
فصل دوم
مواد وروشها
1-2-وسايل آزمايشگاهي:
جدول1-2- وسايل آزمايشگاهي مورد نياز
نام وسايلکشور سازندهمشخصاتديش کشتcm3.5آلمانNunkفلاسک کشت 2cm75اروپاTPP 90076فلاسک کشت 2cm25اروپاTPP 90076لوله سانتريفيوژcc15آلمانNunkلوله سانتريفيوژcc 50آلمانNunkظروف کشت 24 خانه ايآلمانNunkظروف کشت 96 خانه ايآلمانNunkپيپت استريل 5 سي سيBIOFILپيپت استريل10 سي سيBIOFILپيپت پاستور يکبار مصر فايرانCell scraper30آلمانNunkفيلتر سرنگي 0.2ماکرومترآمريکاMilliporeسرنگ با سر سوزن شماره 22ايرانشرکت اروم سرنگست تشر يحسر سمپلرآلمانEppendorp
2-2- مواد:
2-2- جدول مواد مورد نياز
نام موادکشور سازندهمشخصاتمحيط کشت DMEMآمريکاSigma D8437پني سيلين استروپتومايسيناسترالياPAA P11-010FBSاسترلياPAA A15-104PbsاسترلياPAA H15-002تريپسين-EDTAآلمانGIBCOالکل 70%آب ژاولفرماآلدئيدايرانشيمي پژوهش آسياپارافرماآدئيدايرانشيمي پژوهش آسياتريتون 100-xآمريکا066K0089 Sigmaآنتي نستينآمريکاmillipore MAB353? توبولين?اسرائيلT8660 sigmaAnti mouse IgG FITCآمريکاMillipore AP124FKCLآلمانMerc k91423736711کرزيل ويولهآلمانMerc 105235
2-3- دستگاهها:
جدول2-3- دستگاهها
نام دستگاههاکشور سازندهمدلآونآلمانMemertاتوکلاوايرانابزار طب ماهانانکوباتور2coآلمانMemertلوپآلمانmoticميکروسکوپ اينورتآلمانmoticهود لامينارايرانGTLVC2Xبن ماريترکيهNUVEPHمترآلمانjenwayلام نئوبارآلمانHGBسمپلرآلمانEppendorpدستگاه فلو سايتومتريBD FACSCALIBURسانتريفيوژترکيهNUVE
2-روش تحقيق:
2-1- مدل حيواني مورد استفاده:
در تمام مراحل اين پروژه از موشهاي نر و ماده نژاد Balb/cبه عنوان مدل حيواني استفاده شد. موشها تحت شرايط استاندارد دما و رطوبت نگهداري شدند و تغذيه با آب جوشيده و غذا (پلتها غذايي خريداري شده از انسيتو پاستور ايران – آمل) صورت گرفت.
2-2- تهيه محيط کشت :
محيط کشت مصرفي DMEM/F12 (Dulbeccos Modified Eagles Medium) حاوي سديم بي کربنات و l-glutamin و HEPES بود که به آن 10%FBS(Fetal Bovine Serum) و1% پني سيلين استروپتومايسين اضافه شد، در واقع براي هر بار



قیمت: تومان


پاسخ دهید