دانشکده علوم
پايان نامهي کارشناسي ارشد در رشتهي
زيست شناسي سلولي – مولکولي
بررسي ارتباط چند شکليهاي ژنتيکي CAT C-262T و NQO1 C609T با خطر رد حاد پيوند کبد
به کوشش:
احسان احمدي
استاد راهنما:
دکتر ايرج سعادت

شهريور1393
به نام خدا
اظهار نامه
اينحانب احسان احمدي (9130324) دانشجوي رشته ي زيست شناسي گرايش سلولي – مولکولي دانشکده علوم اظهار مي کنم که اين پايان نامه حاصل پژوهش خودم بوده و در جاهائي که از منابع ديگران استفاده کرده ام، نشاني دقيق و مشخصات کامل آن را نو شته ام. همچنين اظهار مي کنم که تحقيق و موضوع پايان نامه ام تکراري نمي باشد و تعهد مي نمايم که بدون مجوز دانشگاه دستاوردهاي آن را منتشر ننموده و يا در اختيار غير قرار ندهم. کليه حقوق اين اثر مطابق با آيين نامه مالکيت فکري و معنوي متعلق به دانشگاه شيراز است.
نام ونام خانوادکي: احسان احمدي
تاريخ و امضاء: 31/6/1393
تقديم به
پدر و مادر عزيز و مهربانم
که در سختي‌ها و دشوار‌ي‌هاي زندگي همواره ياوري دلسوز و فداکار و پشتيباني محکم و مطمئن برايم بوده‌اند.
سپاسگزاري
استاد گراميم جناب آقاي دکتر ايرج سعادت بسيار سپاسگذارم چرا که بدون راهنمايي هايتان، بدون آن همه صبر و بردباريتان تامين اين پايان نامه امکان پذير نبود.
از استاديد گراميم جناب آقايان دکتر مصطفي سعادت و دکتر محمد حسين کريمي بسيار سپاسگذارم چرا که بدون مشاورات و کمک هاي ايشان تامين اين پايان نامه دور از ذهن بود.
چکيده
بررسي ارتباط چند شکليهاي ژنتيکي NQO1 C609T و CAT C-262T
با خطر رد حاد پيوند کبد
به کوشش:
احسان احمدي
پيوند کبد راه درماني مناسبي براي بيماران مبتلا به بيماري هاي کبدي است. عليرغم پيشرفت چشمگير اين روند درماني، هنوز به دليل پاسخ ايمني فرد دريافت کننده بافت در برابر بافت پيوندي، رد پيوند اتفاق مي افتد و عامل اصلي عدم موفقيت اين روش است. کبد پيوندي مستعد قرار گرفتن در معرض رد حاد به دلايل متفاوت از جمله استرسهاي اکسيداتيو است. آنزيمهاي NQO1و CAT از جمله آنزيمهاي آنتياکسيدان هستند. هدف از اين پژوهش بررسي ارتباط چندشکليهاي NQO1 C609T (rs1800566) و CAT C-262T (rs1001179) با رد حاد پيوند کبد است. در اين مطالعه 217 بيمار دريافت کننده پيوند کبد که 47 نفر از آنها داراي رد حاد بودند و 217 فرد سالم به عنوان کنترل مورد بررسي قرار گرفتند. سپس ژنوتيپ ها توسط روش PCR-RFLP تعيين شد و دادهها توسط نرمافراز آماري SPSS تحليل شدند. پس از بررسي فراواني آللي و ژنوتيپي در چندشکلي CAT C-262T بين دو گروه بيماران کبدي منجربه پيوند کبد و شاهد و همچنين بيماران داراي رد حاد و فاقد رد حاد پيوند کبد تفاوت معناداري مشاهده نشد. به عبارت ديگر فراواني آللي و ژنوتيپي ژن CAT در چندشکلي ياد شده در بروز بيماريهاي کبدي منجر به پيوند و همچنين رد حاد پيوند کبد نقشي ندارد. در بررسي ژنNQO1 نيز اختلاف معناداري ميان دو گروه شاهد و بيماران کبدي منجربه پيوند کبد مشاهده نشد. اما بررسي ها در بين بيماران پيوندي داراي رد حاد و فاقد رد حاد نشان داد ژنوتيپ TT نسبت به حضور حداقل يک آلل C (CC+CT) به ميزان 92/3 برابر احتمال رد حاد پيوند کبد را افزايش مي دهد(92/3OR=، 08/1-20/14CI=، 037/0P=). اين بدين معني است که ژنوتيپ TT باعث کاهش فعاليت NQO1 شده که منجر به بالا رفتن استرس هاي اکسيداتيو مي شود و در نهايت باعث رد پيوند کبد مي شود.
واژگان کليدي: پيوند کبد، رد حاد، استرس اکسيداتيو، CAT، NQO1
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول مقدمه
1-1 کبد2
1-2 رد پيوند3
1-2-1 رد فوق حاد3
1-2-2 رد حاد4
1-2-3 رد مزمن4
1-2-4 رد حاد پيوند کبد4
1-2-4-1 اپيدميولوژي رد حاد پيوند کبد5
1-2-4-1-1 آنتي باديهاي ضد HLA6
1-2-4-1-2 آنتي بادي عليه آنتي ژنهاي گروه خوني6
1-2-4-1-3 افزايش سن اهداکننده و دريافت کننده پيوند7
1-2-4-1-4 اهدا کننده بافت7
1-3 استرس اکسيداتيو و آنتي اکسيدانت ها7
1-3-1 کاتالاز8
1-3-2 کوئينون اکسيدوردوکتاز1 NAD(P)H (NQO1):10
1-4 هدف11
1-5 فرضيه:12
عنوان صفحه
فصل دوم مروري بر مطالعات انجام شده
2-1 مطالعات انجام شده بر روي ژن کاتالاز14
2-2 مطالعات انجام شده بر روي ژن NQO117
2-3 مطالعات پيشين انجام شده در خصوص پيوند کبد:18
فصل سوم روش کار
3-1 نمونه گيري:21
3-2 وسايل مورد نياز22
3-2-1 محلولهاي استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه خون کامل22
3-2-2 محلولهاي استفاده شده جهت استخراج DNA از نمونه بافي کت22
3-2-3 مواد لازم جهت انجام PCR22
3-2-4 مواد لازم جهت انجام الکتروفورز22
3-2-5 مواد استفاده شده جهت اثر دادن آنزيم محدود کننده23
3-3 استخراج DNA از خون محيطي23
3-4 استخراج DNA از بافي کت با کيت DNP23
3-5 PCR24
3-6 الکتروفورز27
3-7 رنگ آميزي ژل28
3-7 تحليل آماري29
فصل چهارم نتايج
4-1 مشخصات افراد شرکت کننده در اين مطالعه31
4-2 نتايج حاصل از بررسي ريسک فاکتور هاي دخيل در رد پيوند کبد و مشخصات بيماران31
عنوان صفحه
4-3 نتايج حاصل از بررسي چند شکلي ژن CAT درافراد سالم و بيماران پيوند کبد33
4-4 مقايسه ي فراواني ژنوتيپي و آللي بين دو گروه سالم و بيمار در ژن کاتالاز34
4-5 مقايسه ي فراواني ژنوتيپي و آللي بين بيماران با رد حاد پيوند و بيماران فاقد رد حاد پيوند در ژن کاتالاز35
4-6 نتايج حاصل از بررسي چند شکلي ژن NQO1 درافراد سالم و بيماران پيوند کبد35
4-7 مقايسه ي فراواني ژنوتيپي و آللي بين دو گروه سالم و بيمار ژن NQO136
4-8 مقايسه ي فراواني ژنوتيپي و آللي بين بيماران با رد حاد پيوند و بيماران فاقد رد حاد پيوند در ژن NQO137
فصل پنجم بحث و نتيجه گيري
5-1 بحث و نتيجه گيري39
5-2 پيشنهادات:43
فهرست منابع44
فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه
جدول3-1: مشخصات گروه شاهد و کنترل21
جدول 3-2: مواد مورد نياز جهت تهيه مخلوط واکنش PCR24
جدول 3-3: برنامه تنظيم شده براي واکنش PCRجهت تکثير ژن NQO125
جدول 3-4: قطعات حاصل از هضم آنزيمي براي ژنوتيپ هاي چندشکلي ژنتيکي NQO126
جدول 3-5: برنامه تنظيم شده براي واکنش PCRجهت تکثير ژن CAT26
جدول 3-6: قطعات حاصل از هضم آنزيمي براي ژنوتيپ هاي چندشکلي ژنتيکي CAT27
جدول 1-4 بررسي ريسک فاکتورهاي دخيل در رد پيوند کبد و مشخصات بيماران32
جدول 2.4- بررسي ريسک فاکتورهاي کمي دخيل در رد پيوند کبد و مشخصات بيماران32
جدول 4-3 مقايسه ژنوتيپ هاي ژن کاتالاز در گروه سالم و بيمار پيوند کبد33
جدول 4-4 آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي ژن کاتالاز34
در بين گروه سالم و بيماران پيوند کبد34
جدول 4-5 آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي در ژن کاتالاز در بين بيماران پيوند کبد35
جدول 4-6 مقايسه ژنوتيپ هاي ژن NQO1 در گروه سالم و بيمار پيوند کبد36
جدول 4-7 آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي ژنNQO1 در بين گروه سالم و بيماران پيوند کبد36
جدول 4-8 آناليز توزيع فراواني هاي ژنوتيپي و آللي در ژن NQO1 در بين بيماران پيوند کبد37
فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه
شکل 3-2: نتايج حاصل از PCR -RFLP چند شکلي ژنتيکي NQO1 C609T بر روي ژل آگاروز29
شکل 3-1: نتايج حاصل از PCR -RFLP چند شکلي ژنتيکي CAT C-262T بر روي ژل آگاروز28
شکل 1-1 ساختار ژن CAT و چندشکلي ژنتيکي CATC-262T10
شکل 2-1- ساختار ژن NQO1 و چند شکلي ژنتيکي NQO1 C609T11
فصل اول
مقدمه
1-1 کبد
کبد يکي از پرکارترين اعضاي بدن است که بسياري از فعاليت هاي حياتي در آن انجام مي شود يکي از کارهاي مهم آن سم زدايي است. در سم زدايي، کبد مواد نامحلول را به مواد بي خطر و محلول در آب تبديل و به ادرار يا صفرا منتقل مي کند ((Liska et al, 1998.
سم زدايي شامل دو مرحله است:
در مرحله اول خانواده سيتوکروم P450 نقش بسيار مهمي را بازي مي کنند که اولين دفاع آنزيمي در برابر ترکيبات خارجي است. اين آنزيم ها با استفاده از اکسيژن و کوفاکتور NADPH، گروه فعالي مثل OH را به مواد اضافه کرده و باعث توليد مواد قطبي مي شوند که امکان دارد از حالت اوليه خود بسيار خطرناک تر باشند. اگر اين مولکول ها توسط مرحله دوم خنثي نشوند امکان دارد به پروتئين ها, DNA يا RNA سلول ها آسيب بزنند. در اين مرحله راديکال هاي آزاد نيز تشکيل مي شوندLiska et al, 1998) ( Vermeulen NPE et al, 1994,.
مطالعات بسياري رابطه بين فاصله زماني بين اين دو فاز با ابتلا به بيماري هايي مثل سرطان را بررسي کرده اند .(Meyer UA et al, 1990)اگر فاصله زماني اين دو فاز زياد باشد يا آنزيم هاي فاز دو به علت افزايش بيش از حد مواد اشباع باشند صدمات جبران ناپذيري به کبد وارد مي شود ((Liska D et al, 1998.
در مرحله دوم سلول هاي کبد موادي مانند گلوتاتيون، سولفور و اسيد آمينه را به مواد حاصل از مرحله يک اضافه و باعث افزايش حلاليت آنها در آب يا صفرا مي شوند .گلوتاتيون از موادي است که باعث خنثي شدن راديکال هاي آزاد و مواد حاصل از مرحله يک مي شود و حضور آن براي بدن ضروري است. اگر متابوليت هاي حاصل مرحله يک به حدي زياد باشند که مقدار گلوتاتيون ها براي خنثي سازي آنها کافي نباشد، کبد آسيب مي بيند. از آنزيم هاي مهم اين فاز گلوتاتيون s- ترانسفرازها هستند که اتصال گلوتاتيون به محصول مرحله يک را کاتاليز مي کنند (Liska (et al, 1998.
آسيب به کبد گاهي باعث از دست رفتن بافت کبد مي شود. بيماري هاي متفاوتي مانند سيروز، هپاتيت و … مي تواند باعث اين امر شود. سيروز به التهاب شديد کبد مي گويند و از نظر پاتولوژي مشخصات معيني دارد که از دلايل عمده آن مي توان به الکليسم و بيماري هپاتيت C اشاره کرد. درمان در موارد پيشرفته بيماري هاي کبدي با پيوند کبد است.(Mazzeferro V et al, 1996) زماني که به هر دليلي عملکرد کبد دچار اختلال شود و اين اختلال برگشت پذير نباشد پيوند کبد مطرح مي شود. از مهمترين چالش هاي پيش روي پيوند کبد رد پيوند است که باعث کاهش موفقيت در اين روش درماني مي شود.

1-2 رد پيوند
اصليترين علت عدم موفقيت در پيوند، پاسخ سيستم ايمني فرد گيرنده در برابر بافت اهداشده است. چنانچه گيرنده آلوگرافت کبد، داراي سيستم ايمني کاملا سالمي باشد، عمل پيوند تقريبا در تمامي موارد منجر به نوعي از رد ميشود. رد پيوند پروسهاي با مکانيسمهاي متفاوت است. آنتيباديها، سيستم کمپلمان، سلولهاي T و ساير انواع سلولي در رد پيوند دخيل هستند ( et al, 2011 Gavela Mart?nez). آلوآنتي ژنها هر دو دسته پاسخهاي ايمني با واسطه سلولي و همورال را برميانگيزند. با توجه به پيشينه رد پيوندهاي کبدي، الگوي هيستوپاتولوژيک رد پيوند را به سه دسته فوق حاد، حاد و مزمن طبقه بندي ميکنند (Abbas et al, 2011).

1-2-1 رد فوق حاد
اين شکل از رد پيوند در فاصله زماني کوتاهي بين چند دقيقه تا چند ساعت بعد از پيوند با واسطه سيستم ايمني هومورال اتفاق ميافتد. در اين شرايط تورم، ترومبوز عروقي، خونريزي و انفارکتوس در گرافت ديده ميشود. اين واکنشها از فعاليت آنتيباديهاي سيستم کمپلمان و سلولهاي اندوتليال گرافت ناشي شده و باعث تغييرات پيش انعقادي و در نتيجه از بين رفتن بافت ميشوند (Al-rabia, 2009).

1-2-2 رد حاد
سلولهاي T و آنتي باديها معمولا پس از اولين هفته پيوند، باعث ايجاد نوعي آسيب عروقي و پارانشيمي ميشوند که رد حاد نام ميگيرد. مطالعات در سويههاي خالص موش نقش محوري مولکولهاي کمک تحريکي و کموکاينها را در رد حاد پيوند نشان داده است. برخي از واسطههاي التهابي به عنوان مثال، IFN? ميتوانند حساسيت پيوند به آسيب را تغيير دهند (Cornell et al, 2008).
1-2-3 رد مزمن
در پيوندهاي داراي عروق که بيش از شش ماه باقي ماندهاند با تکثير سلولهاي عضلاني صاف، انسداد شرياني به آرامي گسترش مييابد و در نهايت موجب آسيب ايسکميک و رد پيوند ميشود. از ويژگيهاي اين نوع رد پيوند کاهش پيشرونده عملکرد کبدي، حمله به پارانشيم کبد توسط سلول هاي T و نفوذ مداوم مايعات ميان بافتي توسط سلول هاي T و ماکروفاژها است (Cornell et al, 2008). رد مزمن در بافتهاي مختلف شواهد فيزيولوژيکي گوناگوني را نشان ميدهد.
1-2-4 رد حاد پيوند کبد
از انواع مهم رد حاد پيوند ميتوان به رد حاد با واسطه آنتيباديها و رد حاد با واسطه سلولهاي T اشاره کرد. رد حاد با واسطه آنتيبادي اغلب از چند روز تا چند هفته پس از پيوند آغاز ميشود. اولين نشانه در اين نوع از رد پيوند اختلال سريع در عملکرد گرافت ناشي از التهاب است. با عملکرد آنتيباديهايي که از قبل در بدن وجود دارند، فعاليت سيستم کمپلمان عليه گرافت آغاز ميشود. هدف اصلي اين آنتيباديها MHC هاي سطحي سلولهاي اندوتليال و مويرگهاي گرافت هستند( Nankivell et al, 2010).
رد حاد سلولي با تجمع سلولهاي تک هستهاي در فضاي ميان بافتي و التهاب شريانها مشخص ميشود. اکثر سلولهاي تک هستهاي که در فضاي ميان بافتي نفوذ ميکنند، سلولهاي T CD4+ و CD8 + هستند. رد حاد پيوند کبد شامل التهاب شديد بافت پيوندي است که ابتدا روي مجاري صفراوي، سلول هاي اندوتليال، سياهرگ پورتال و رگ هاي کوچک کبدي اثر مي گذارد و گاهي شامل سرخرگ کبدي و انشعابات آن نيز مي شود. رد پيوند حاد به دو صورت کلينيکي و بافتي قابل تشخيص است. نوع کلينيکي با علائمي مثل تب، يرقان و گاهي بزرگ شدن شکم همراه است. در اين زمان ميزان آنزيم هاي کبدي مانند آلانين آمينو ترانسفراز، آسپارتات آمينوترانسفراز، بيلي روبين کل و بيلي روبين مستقيم، دچار تغيير مي شوند. در نوع بافتي انجام بيوپسي از بافت تاييد کننده رد پيوند است که علائم آن عبارت است از:
الف-تخريب و التهاب سياهرگ پورتال، افزايش تعداد لنفوسيتهاي فعال،نوتروفيل و ائوزينوفيل
ب- تخريب و التهاب مجاري صفراوي ج- التهاب بافت زير اندوتليال سياهرگ پورتال.
حداقل دو مورد از سه ويژگي بالا براي تاييد ردحاد پيوند مورد نياز است. با بروز علائم رد حاد پيوند از داروهاي سرکوب کننده بيشتري استفاده مي کنند (Banff, 1996). با درمانهاي فعلي، بروز رد حاد حدود 5 تا 10 درصد در سال اول در بيماران کاهش مييابد (Cornell et al, 2008).

1-2-4-1 اپيدميولوژي رد حاد پيوند کبد
با ساخت و کشف داروها و روش هاي متفاوت و کارآمد در پيوند کبد ميزان بقا بيماران پيوندي به 80 درصد در يک سال رسيده است.( Cristina A et al,1999) تعدادي از عوامل که بقاء کوتاه مدت پيوند را تحت تأثير قرار ميدهند عبارتند از: عملکرد تأخيري پيوند (DGF) ، آنتي بادي هاي ضد HLA، نوع اهدا کننده پيوند، گروه خوني، افزايش سن دهنده و گيرنده پيوند، وزن گيرنده، فشار خون بالا، ديابت و… از عوامل خطر قابل توجه براي از دست دادن پيوند ميباشند که برخي از اين عوامل را به اختصار توضيح ميدهيم.

1-2-4-1-1 آنتي باديهاي ضد HLA
پاسخهاي خود ايمني عمدتأ عليه مولکول هاي سطح سلول که تحت عنوان مولکولهاي MHC خوانده مي شوند، انجام ميگيرد. مولکولهاي MHC در انسان آنتيژن لکوسيت انساني (HLA) ناميده ميشوند. اين مولکولها مسئول ارائه آنتيژنهاي خارج و داخل سلولي به سلولهاي سيستم ايمني از جمله سلولهاي T هستند. سلولهاي T قادرند مولکول MHC خارجي سلولهاي پيوندي (به طور مستقيم) يا بعد از پردازش مجدد در سطح گيرنده سلولهاي عرضه کننده آنتيژن (غير مستقيم) تشخيص بدهد. بدن به طور معمول به مولکول هاي MHC که از قبل در بدن وجود داشته پاسخ نميدهد مگر اينکه از طريق بارداري، انتقال خون يا پيوند در معرض سلولهاي خارجي قرار بگيرند. هر چه ميزان سازگاري مولکولهاي MHC دهنده با گيرنده بيشتر باشد سيستم ايمني ميزبان کمتر تحريک شده و پايداري بافت افزايش مييابد (Morris PJ et al, 2004). اهميت آنتيژنهاي MHC در انسان بديهي است به طوري که ميزان طول عمر بقاي پيوند در پيوندهاي خواهر برادري با HLA مشابه به طور قابل توجهي بالاتر از پيوند خواهر برادري با HLA غيرمشابه ميباشد. (Nankivell BJ et al, 2010) تقريبأ 25 % از رد حاد به علت آنتيبادي عليه آنتيژنهاي HLA دهنده صورت ميگيرد (Colvin RB et al, 2007).

1-2-4-1-2 آنتي بادي عليه آنتي ژنهاي گروه خوني
در پيوند کبد، گروه خوني دهنده کبد به طور معمول با گروه خوني گيرنده سازگار است. با اين حال، پيوند کبد در گيرندههايي که با فرد دهنده از نظر گروه خوني ناسازگاراند نيز با موفقيت، با استفاده از يک پروتکل تجربي پلاسمافرز يا immunoadsorption که مستلزم حذف آنتيبادي در گيرنده پيوند بعد از عمل است، صورت ميگيرد. پس از حذف، آنتي باديهاي ضد گروه خوني به سطح قبل از پيوند افزايش مييابند .(Lynch RJ et al, 2008)
1-2-4-1-3 افزايش سن اهداکننده و دريافت کننده پيوند
در مطالعهاي که در سال 2010 بر روي عوامل خطر مؤثر در از دست رفتن پيوند انجام شد، نتايج نشان داد که سن اهدا کننده يک عامل پيش آگهي و قابل توجه براي از دست رفتن پيوند است، بدين صورت که با افزايش يک سال در سن دهنده، خطر نسبي از دست رفتن پيوند 05/1 برابر افزايش مييابد .(Khalkhali HR et al, 2010)

1-2-4-1-4 اهدا کننده بافت
اينکه بافت پيوندي از فرد زنده دريافت شده باشد يا از فرد دچار مرگ مغزي، در بقاي طولاني مدت پيوند تأثيرگذار خواهد بود. به طوري که در بيماراني که از فرد زنده و به خصوص از خويشاوندان درجه اول بافت ميگيرند رد پيوند کاهش مييابد. تا سال 1387 در حدود 95-90 % کل پيوند اعضاء از اهدا کنندگان زنده و 5 تا 10 درصد آن از طريق پيوند از جسد انجام ميگرفت، در حال حاضر، 96 درصد پيوندها از جسد و تنها حدود 4 درصد از پيوندها از اهدا کننده زنده دريافت ميشود. در خصوص پيوند کبد در اغلب موارد بافت پيوندي از جسد گرفته مي شود مگر در مواردي که دريافت کننده کودک باشد. همچنين مطالعات انجام شده در اين خصوص حاکي از آن است که حدود 50-20 %، وقوع DGF در بيماراني که از جسد بافت دريافت ميکنند افزايش مييابد که ناشي از اثرات سيستميک مرگ مغزي دهنده يا آسيب اسيکمي- ريپرفيوژن حين عمل ميباشد.(Nankivell BJ et al, 2010, Giral Classe M et al, 1998)

1-3 استرس اکسيداتيو و آنتي اکسيدانت ها
استرس اکسيداتيو در نتيجهي افزايش غلظت گونههاي فعال اکسيژن (ROS) و يا کاهش آنتي اکسيدانتها صورت ميگيرد. (Crawford DA et al, 2011) که نشان دهندهي عدم تعادل در ميزان توليد راديکالهاي آزاد و توانايي سيستم دفاع آنتي اکسيداني در رفع واسطههاي واکنش (ROS) و يا ترميم آسيب به وجود آمده مي باشد. اثرات سمي ناشي از استرس اکسيداتيو که از طريق توليد پراکسيدها و راديکالهاي آزاد ايجاد ميشود به تمام اجزاي سلول از جمله: پروتئينها، ليپيدها و DNA آسيب ميرساند. علاوه بر اين، گونههاي فعال اکسيژن به عنوان يک عامل پيامرسان در سيگنالينگ اکسيد و احياء عمل ميکنند، بنابراين استرس اکسيداتيو ميتواند باعث اختلال در مکانيسمهاي طبيعي سيگنالينگ سلولي شود.
در انسان استرس اکسيداتيو در توسعه سرطان (Barry H et al, 2007)، بيماري پارکينسون و آلزايمر (Valko M et al, 2007)، آترواسکلروز، نارسايي قلبي (Singh N et al, 1995)، سندرم x شکننده (Diego-Otero Y et al, 2009)، بيماري خوني سلول داسي شکل (Amer J et al, 2006) و چند بيماري ديگر دخيل است. استرس اکسيداتيو شديدتر ميتواند باعث مرگ سلولها شود، استرس اکسيداتيو در حد متوسط ميتواند آپوپتوز را آغاز کند، در حاليکه تنشها شديدتر باشد ممکن است باعث نکروز شدن گردد (Lennon SV et al, 1991). براي حفظ عملکرد سلولي در برابر ROS، سلولها سيستم دفاعي آنزيمي (به عنوان مثال: سوپر اکسيد ديسموتاز، کاتالاز و گلوتاتيون پراکسيداز) و غير آنزيمي (به عنوان مثال: گلوتاتيون و ويتامين هايي با نقش آنتي اکسيدان مثل ويتامين C و E) دارند که به وسيله ي آن ROS راسم زدايي ميکنند (Abdollahi M et al, 2004)0

1-3-1 کاتالاز
کاتالاز آنزيم مشترک در تقريبأ تمام موجودات زنده هوازي ميباشد که تجزيه پراکسيد هيدروژن (H2O2) به آب و اکسيژن را کاتاليز ميکند. (Chelikani P et al, 2004) کاتالاز مجموعهاي از چهار زير واحد يکسان (تترامر) است که هر زير واحد آن داراي وزن مولکولي در حدود 60 کيلو دالتون ميباشد و هر زير واحد داراي يک گروه هِم ميباشد. (Nagem R et al, 1999)
ژن کاتالاز 34 کيلو جفت باز طول دارد و شامل 12 اينترون و 13 اگزون مي باشد. بخش پروموتر ژن کاتالاز غني از GC و فاقد جعبهي TATA ميباشد. ژن کاتالاز انسان بر روي بازوي کوتاه کروموزوم شماره 11 در موقعيت 13 اين ژن (13P11) قرار گرفته است. (Quan F et al, 1986) تومور ويلمز (Wilm’s Tumor) يک نئوپلاسم رايج دوران کودکي است که با حذف در اطراف باند 13P کروموزوم 11 همراه است. در بعضي از افراد حذف با کاهش فعاليت آنزيم کاتالاز همراه است. در بافت پستانداران بالاترين سطح آنزيم کاتالاز در کبد، کليه و گلبول هاي قرمز و پايين ترين سطح آن در بافت همبند يافت ميشود. Shinga و همکارانش گزارش کردند که در سلولهاي عضله صاف عروق و سلول هاي اندوتليال آنزيم کاتالاز فاقد فعاليت ميباشد. در بافت کبد کاتالاز به طور غالب در پراکسيزومها و در اريتروسيتهاي بالغ بصورت آزاد در سيتوزول وجود دارد.(Quan F et al, 1986)
تجزيه پراکسيد هيدروژن به آب و اکسيژن بوسيله ي آنزيم کاتالاز، يک فرآيند دو مرحلهاي است:
1)H2O2 + Fe(III)-E ? H2O + O=Fe(IV)-E
2)H2O2 + O=Fe(IV)-E ? H2O + Fe(III)-E + O2

با وارد شدن پراکسيد هيدروژن به جايگاه فعال آنزيم کاتالاز، با اسيد آمينه هاي 147Asn و 74His برهمکنش ميکند و باعث انتقال پروتون (يون هيدروژن) بين اتم هاي اکسيژن ميشود که اين انتقال يون هيدروژن به اتم هاي اکسيژن آزاد سبب تشکيل يک مولکول آب ميشود و Fe3+ به Fe4+ تبديل ميشود. Fe4+ با دومين مولکول هيدروژن پراکسيد واکنش داده، آب و اکسيژن توليد ميکند و به Fe3+ تبديل ميشود .(Vetrano AM et al, 2005)
تعدادي چند شکلي در ژن کاتالاز گزارش شده که بيشتر آنها با آکاتالاسميا که يک صفت آتوزومال غالب بوده و سطح آنزيم کاتالاز گلبولهاي قرمز 2/0-4 % بالاتر از حد نرمال است، همراه ميباشد (Ogata M et al, 1991).
چند شکلي که در اين مطالعه مورد بررسي قرار داديم، جايگزيني باز سيتوزين به تيمين در موقعيت 262- پروموتر ژن کاتالاز بود که افراد حامل آلل T (CT, TT) نسبت به افراد هموزيگوت براي آلل C(CC) به طور قابل توجهي سطح کمتري از آنزيم کاتالاز را نشان ميدهند .(Ahn J et al, 2006)
ساختار ژن CAT و جايگاه چند شکلي مورد نظر در شکل زير آمده است.

شکل 1-1 ساختار ژن CAT و چندشکلي ژنتيکي CATC-262T

1-3-2 NAD(P)H کوئينون اکسيدوردوکتاز1 (NQO1):
NQO1 يک آنزيم سيتوزولي است که قبلأ تحت عنوان DT-diaphorase ناميده ميشد، از آنزيمهاي مهم در متابوليسم زنوبيوتيکها به شمار ميآيد. اين آنزيم احياء دو اکتروني ترکيبات quinoid به هيدروکوئينون را کاتاليز ميکند. از توليد راديکالهاي آزاد و گونه هاي فعال اکسيژني جلوگيري ميکند، در نتيجه از سلولها در برابر آسيب اکسيداتيو محافظت ميکند. همچنين فعال سازي برخي از مواد زيست محيطي پيش ساز سرطان موجود در دود توتون و تنباکو مانند ترکيبات نيتروآروماتيک و آمين هاي هتروسيکليک را کاتاليز ميکند .(Chen H et al, 1999) ژن اين آنزيم بر روي موقعيت 22 بازوي بلند کروموزوم شماره 16 (22q16) قرار دارد. طول اين ژن 20 کيلو جفت باز است که 5 اينترون و 6 اگزون را در خود جاي داده است
.(Ernster L et al, 1987)
چند شکلي مورد بررسي در اين مطالعه مربوط به جايگزيني بازهاي آلي سيتوزين به تيمين در موقعيت 609 اگزون شماره 6 ژن NQO1 ميباشد که اسيد آمينه پرولين جايگزين سرين ميشود .(Wiencke JK et al, 1997) اين چند شکلي با کاهش فعاليت آنزيم همراه است و در 25-13 % ازجمعيت سفيد پوستان ديده ميشود .(Chen H et al, 1999) به طوري که آنزيم NQO1 در افرادي که ژنوتيپ TT دارند، يا فاقد فعاليت است يا فعاليت کمي دارد.(Siegel D et al, 1999) و افرادي که ژنوتيپ هتروزيگوت (CT) دارند تقريبأ نيمي از فعاليت آنزيم را دارند.

در شکل زير ساختار و جايگاه چند شکلي ژنتيکي ژن NQO1 آمده است:

شکل 2-1- ساختار ژن NQO1 و چند شکلي ژنتيکي NQO1 C609T

1-4 هدف
از آنجا که رد حاد پيوند در حفظ بافت بصورت کوتاه مدت و بلند مدت داراي اهميت است، مطالعات بسياري بر روي عوامل ايمني و غير ايمني مؤثر در رد حاد پيوند انجام گرفته است. چند شکلي ژنتيکي تک نوکلئوتيدي (SNP) از معمولترين تنوعات ژنتيکي در ژنوم انسان هستند و پتانسيل زيادي براي کاربرد در بررسي رابطه آن با تعدادي از بيماريها دارد. راديکالهاي آزاد اکسيژن به عنوان واسطههاي پاتولوژيک در بسياري از بيماري ها دخيل هستند. استرس اکسيداتيو با پيشرفت بسياري از بيماريها از جمله سرطان، بيماريهاي عصبي، ديابت و بيماري مزمن کليوي مرتبط است. يکي از سيستمهاي دفاعي عليه آسيبهاي ناشي از استرس اکسيداتيو در انسان آنزيم کاتالاز و NQO1 ميباشد، از آنجا که استرس اکسيداتيو مي تواند در نکروز شدن بافت تأثير بگذارد، بر آن شديم تا يک چند شکلي در ژن CAT و يک چند شکلي در اگزون 6 ژن NQO1 را بررسي کنيم. اين مطالعه جهت بررسي ارتباط پلي مورفيسمC-262T ژن کاتالاز وC609T ژن NQO1 با رد حاد پيوند کبد در بيماران دريافت کنندهي کبدي پيوندي ميباشد.

1-5 فرضيه:
ژنوتيپTT و CTنسبت به ژنوتيپ CC در چند شکلي ژنتيکي C-262T ژن CAT خطر رد حاد پيوند کبد را افزايش ميدهد.
با افزايش آلل T در ژن CAT، خطر رد حاد پيوند کبد افزايش مييابد.
ژنوتيپ TT و TC از چند شکلي ژنتيکي C609T ژن NQO1 درمقايسه با ژنوتيپ CC خطر رد حاد پيوند کبد را افزايش ميدهد.
با افزايش آلل T در ژن NQO1، خطر رد حاد پيوند کبد افزايش مييابد.

فصل دوم

مروري بر مطالعات انجام شده

2-1 مطالعات انجام شده بر روي ژن کاتالاز
مطالعات بسياري بر روي ژن کاتالاز و رابطه چند شکليهاي ژنتيکي آن با بيماريهاي مختلف انجام گرفته است که به شرح زير ميباشد:
در مطالعهاي که توسط Ahn و همکارانش در سال 2005 در خصوص ارتباط خطر سرطان سينه و ژنوتيپ کاتالاز و استفاده از ميوه و سبزيجات و مکمل هاي غذايي در جزيره لانگ انجام شد نشان داد که فعاليت بالاي ژنوتيپ CC ژن کاتالاز با کاهش 17 % خطر ابتلا به سرطان سينه در مقايسه با افرادي که حداقل يک آلل T دارند (TT,CT) مشاهده شد .(AhnJ et al, 2005)
مطالعهاي در سال 2005 توسط Zhou و همکارانش بر روي دو SNP در پروموتر ژن کاتالاز و ارتباط آن با فشار خون بالا در سفيدپوستان و آمريکاييهاي آفريقايي تبار انجام شد. اطلاعات بدست آمده نشان داد که تغييرات ژنتيکي در منطقه پروموتر ژن کاتالاز با استعداد ابتلا به فشار خون بالا در ارتباط است .(Zhou XF et al, 2005)
در مطالعهاي که توسط Chistiako و همکارانش در سال 2006 در رابطه با چند شکلي CAT C-262T و ارتباط آن با نوروپاتي ديابتي نوع 1 در روسيه انجام شد، نتايج نشان داد که آللT 262- در ژن کاتالاز عليه توسعه سريع بيماري نوروپاتي ديابتي نوع1 نقش حفاظتي دارد (Chistiako DA et al, 2006).
مطالعهاي در سال 2006 توسط Mak و همکارانش در هنگ کنگ چين بر روي بيماران مبتلا به آسم و ارتباط آن با چند شکليCAT C-262T صورت گرفت که نشان داد، آلل T در جمعيت غير سيگاري، در برابر بيماري آسم نقش حفاظتي دارد (Mak et al, 2006).
در مطالعهاي که توسط Zarbock و همکارانش در سال 2007 در ارتباط با خطر بيماري پسودوگزانتوما- الاستيکوم و چند شکلي ژنتيکي C-262T CAT انجام شد، نشان داد که آلل C در اين چند شکلي خطر ابتلا به اين بيماري را افزايش ميدهد (Zarbock R et al, 2007).
در مطالعه اي که توسط Ji-Yeob Choi و همکاران درسال 2007 در بررسي پلي مورفيسمهاي Ala16Val ژن Mn-SOD، C-262T CAT و Pro200Lue ژن GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات بر روي مردان با سابقه کشيدن سيگار يا قرار گرفتن در معرض آزبست بودند انجام شد، هيچ ارتباطي بين ژنوتيپهاي Mn-SOD، CAT و GPX1 و خطر ابتلا به سرطان پروستات ديده نشد.(Choi JY et al, 2007)
در مطالعهاي که توسط Cristiano Capurso و همکارانش در سال 2008 در ارتباط با رابطه چند شکلي C-262T CAT و بيماري آلزايمر انجام شد ، هيچ ارتباطي بين بيماري آلزايمر و اين چند شکلي مشاهده نشد (Capurso C et al, 2008).
مطالعهاي در سال 2009 توسط Piort Galecki و همکارانش بر روي ارتباط بين چند شکلي عملکردي CAT C-262T و احتمال افسردگي صورت گرفت که نتايج بدست آمده نشان داد هيچ ارتباط معني داري بين چند شکلي ژن کاتالاز و خطر ابتلا به افسردگي وجود ندارد .(Galecki P et al, 2009)
در مطالعه اي که بر روي جمعيت مراکش در سال 2010 توسط Sayeh Ezzikouri و همکارانش انجام گرفت، ارتباط چند ژن انتي اکسيدان و خطر سرطان کبد مورد بررسي قرار گرفت. نتايج حاصل نشان داد که در چند شکلي CAT C-262T اختلاف آلل TT در بين گروه شاهد و کنترل معنادار بوده و افراد داراي ژنوتيپ TT داراي ريسک بيشتري براي ابتلاء به سرطان کبد هستند (Ezzikouri S et al, 2010) .
در سال 2010 Grazyna Dutkiewicz و همکارانش در لهستان طي بررسي بر روي افرادي که بافت پيوندي دريافت کرده اند، احتمال ابتلاء به ديابت بعد پيوند را با برخي از چند شکلي ها از جمله CAT C-262T مورد آزمايش قرار دادند و يافتند که ارتباط معناداري بين اين چند شکلي و خطر ابتلاء به ديابت بعد پيوند وجود ندارد ( Dutkiewicz G et al,2010).
در مطالعه اي که توسط Ozbay و همکارانش در سال 2011 بر روي ارتباط بين سطح آنزيمهاي آنتي اکسيدان خون و زمان حمله ميگرن در بيماران مبتلا به ميگرن انجام شد، کاهش آماري قابل توجهي در فعاليت GST-PX3، CAT، SOD و سطوح GSH در بيماران مبتلا به ميگرن در مقايسه با گروه شاهد مشاهده شد.(CAT, GSH P<0/001, GSH, SOD P<0/05) در بيماران مبتلا به ميگرن و گروه شاهد تفاوت معنيداري براي ژنوتيپهاي Mn-SOD و CAT مشاهده نشد اما در ژنوتيپ GSH-PX3 تفاوت معنيدار وجود داشت. تفاوتي در فراواني آللي Mn-SOD، CAT و GHS-PX3 در بين بيماران و گروه شاهد نبود. در نتيجه آنزيمهاي استرس اکسيداتيو و آنتي اکسيدانت ها ممکن است نقش مهمي در پاتوژنز ميگرن ايفا کنند .(Ozbey U et al, 2011)
در مطالعهاي که توسط Chang Dong و همکارانش در سال 2012 در ارتباط با چند شکليCAT -21 A>T با سرطان روده بزرگ انجام شد، تفاوت معنيداري بين ژنوتيپهاي ژن CAT و همچنين فعاليت آنزيمي پايين تر در بيماران مبتلا به سرطان روده بزرگ نسبت به گروه کنترل مشاهده شد. فعاليت کم آنزيم CAT با افزايش ريسک ابتلا به سرطان روده بزرگ در ارتباط است، با اين حال، هيچ مدرکي در حمايت از ارتباط چند شکليCAT A-21T با خطر ابتلا به سرطان روده بزرگ مشاهده نشد.(Chang D et al, 2012)
طي مطالعه اي که در سال 2013 توسط Gaynali و همکارانش در ترکيه بر روي افراد سيگاري در دو دسته مبتلا به سرطان حنجره و سالم انجام شد، ارتباط معناداري با چند شکلي CAT C-262T گزارش نگرديد ( Aynali G et al, 2013).
طي مطالعه اي که در سال 2014 توسط Natsuko Taniguchi و همکارانش در ژاپن بر روي افراد سيگاري صورت گرفت، ارتباط تعدادي چند شکلي در ژن کاتلاز بررسي شد که طي آن يافت شد ارتباط معناداري بين چند شکلي هاي CAT C-262T و CAT A-21T و خطر ابتلاء به آسم وجود ندارد ولي ژنوتيپ TT از چند شکلي هاي CAT C-262T با خطر ابتلاء به آسم در پيري در ارتباط است و احتمال آن را افزايش مي دهد( Taniguchi N et al, 2014).

2-2 مطالعات انجام شده بر روي ژن :NQO1
مطالعهاي درسال 2003 توسط Lin P و همکارانش در ارتباط با بررسي چند شکلي هاي ژنتيکي در ژنهاي NQO1، GSTP1 و Mn-SOD با خطر ابتلا به سرطان ريه در تايوان انجام شد، نشان داد که به طور کلي چند شکلي GSTP1 با خطر ابتلا به سرطان ريه در ارتباط مي باشد. افراد حامل آلل نوع GSTP1 در معرض خطر بالاي سرطان سلولهاي سنگفرشي ريه هستند (Lin P et al, 2003).
در مطالعهاي که توسط Pandith A و همکارانش در سال 2011 در جمعيت کشميري بر روي ارتباط بين چند شکلي ژنتيکي C609T NQO1 و سرطان مثانه انجام شد، نشان داد که آلل T خطر ابتلا به سرطان مثانه را افزايش ميدهد .(Pandith A et al, 2011)
مطالعهاي ديگر در سال 2011 توسط Stavropoulou C و همکارانش در ارتباط با چند شکلي C609T NQO1 و خطر ابتلا به بيماري هاي آلزايمر و پارکينسون انجام گرفت که در آن آلل T خطر ابتلا به اين بيماري ها را افزايش ميداد.(Stavropoulou C et al, 2011)
متا آناليزي در سال 2012 توسط Zhang و همکارانش در رابطه با چند شکليNQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان معده در آسياييها انجام شد. نتايج حاصل از مقايسه آلل T و آلل C اين ژن نشان داد که در افراد داراي آلل T نسبت به افراد داراي آلل C، به طور قابل توجهي شانس ابتلا به سرطان معده افزايش مييابد .(Zhang Y et al, 2012)
متا آناليزي در سال 2013 توسط Zhu CL و همکارانش در رابطه با چند شکليC609T NQO1 با سرطان دستگاه گوارش (DTC) انجام شد که نشان داد که به طور کلي از لحاظ آماري ارتباط معني داري بين چند شکلي اين ژن و خطر DTC وجود دارد (Zhu CL et al, 2013).
در سال 2013 توسط Hu Yanlig و همکارانش متا آناليزي در ارتباط با بررسي چند شکليC609T NQO1 و خطر ابتلا به سرطان مري انجام شد که نتايج بدست آمده نشان داد که ارتباط معنيداري بين ژنوتيپ TT از چند شکلي C609T NQO1 و سرطان مري وجود دارد (Yanlig H et al, 2013).
مطالعهاي در سال 2013 توسط Liu و همکارانش در بررسي ارتباط چند شکلي عملکردي NQO1 C609T و خطر ابتلا به سرطان سلولهاي کبدي در جمعيت چين انجام شد. نتايج نشان داد در افرادي که ژنوتيپ TT دارند در مقايسه با افراد داراي ژنوتيپ CC به طور قابل توجهي خطر ابتلا به سرطان سلولهاي کبدي افزايش مييابد (Liu F et al, 2013).

2-3 مطالعات پيشين انجام شده در خصوص پيوند کبد:
بررسي ها نشان مي دهد که ارتباط معني داري بين نوع بيماري و خطر رد حاد پيوند وجود دارد و افراد داراي بيماري PBC، هپاتيت B و هپاتيت C به علت ضعيف بودن سيستم ايمني کمتر از ساير بيماران به رد حاد پيوند کبد مبتلا مي شوندSeiler, 1999, Farges, 1996, Berlakovich., 2011) ) همچنين Wiensner و همکارانش در سال 1998 ارتباط معني داري بين ميزان بالاي ALT1 ، نوع بيماري، رژيم درماني و سن بيمار با رد حاد پيوند کبد مشاهده کردند. در سال 2010Azarpira, و همکارانش گزارش کردند که ارتباطي بين چند شکلي ژن هاي GSTM1 و GSTT1و خطر رد حاد پيوند وجود ندارد اما رابطه معني داري با افزايش سن بيماران مشاهده کردند.
در مطالعه اي که در سال 2010 در نيويورک توسط Navdeep Dhillon و همکارانش بر روي ارتباط رد پيوند کبد با چند شکلي در ژن گيرنده TLR42 صورت گرفت رابطه معنا داري بين اين چند شکلي و رد پيوند کبد مشاهده گرديد( Dhillon N et al, 2010).
در مطاله ديگر که در اسپانيا و در سال 2011 توسط M.J. Citores و همکارانش انجام شد، ارتباط رد حاد پيوند کبد در بيماران پيوند کبدي که به علت آلودگي با ويروس هپاتيت C مجبور به پيوند کبد شده اند با ده چند شکلي در ژن گيرنده TLR(TLR1-10) مورد بررسي قرار گرفت که نتايج حاصل نشان داد که تنها چند شکلي در ژن3 TLR3 با رد حاد پيوند کبد در ارتباط است ( Citores M et al, 2011).
طي مطالعه اي که در سال 2013 در چين توسط Zhijun Jiang و همکارانش انجام شد رابطه چند شکلي آنتي ژن 4 لنفوسيت T کشنده(CTLA-4) با خطر رد حاد پيوند کبد مورد بررسي قرار گرفت که نتايج آن نشان داد که اين چند شکلي رابطه معناداري با رد حاد پيوند کبد ندارد ( Jiang Z et al, 2013).
در سال 2012 در ايتاليا توسط Bitetto D و همکارانش مطالعه اي در بين افرادي که بافت کبد پيوندي دريافت کرده بودند براي يافتن ارتباط بين رد حاد پيوند کبد با چند شکلي در ژن انترلوکين28(IL-28B) انجام دادند. نتايج اين بررسي نشان داد که اختلاف معناداري در بين افرادي که بافت کبد پيوندي آنها رد شده و آنهايي که رد حاد صورت نگرفته در ژنوتيپ اينترلوکين28 وجود دارد ( Bitetto D et al, 2012).
در سال 2013 در نيويورک توسط Sridhar R. Allam و همکارانش بررسي براي يافتن ارتباط بين بقاي بافت پيوندي در افراد دريافت کننده پيوند کبد با چند شکلي در ژن اينترلوکين 28(IL-28B) صورت گرفت که طي آن مشخص شد ارتباط معنا داري وجود دارد و حضور آلل C باعث افزايش بقاي بافت کبد پيوندي در گيرندگان کبد مي شود ( Allam RS et al, 2013).
Xiaobo Yu و همکارانش در سال 2014 در چين به بررسي ارتباط چند شکلي فاکتور 5 تنظيمي اينترفرون(IRF5) و رد حاد پيوند کبد پرداختند که در اين رابطه به اين نتيجه دست يافتند که چند شکلي در اين ژن ارتباط



قیمت: تومان


پاسخ دهید